测定蛋白质相对分子质量.pptx

【目的要求目的要求目的要求目的要求】学习学习SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。运运用用SDS-PAGESDS-PAGE测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量及及染染色色鉴鉴定。定。【实验原理实验原理实验原理实验原理】电泳电泳电泳电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象极移动的现象。PAGE PAGE PAGE PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（PAGPAG）是由）是由单体单体单体单体丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)(Acr)和和交联剂交联剂交联剂交联剂甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)(Bis)在在加速剂加速剂加速剂加速剂四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMEDTEMED)和和引发剂引发剂引发剂引发剂过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)的作用下的作用下聚合交联而成聚合交联而成聚合交联而成聚合交联而成的三维网状结构的凝胶的三维网状结构的凝胶的三维网状结构的凝胶的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳以此凝胶作为支持介质的电泳称为称为PAGEPAGEPAGEPAGE。PAGEPAGEPAGEPAGE具有电泳和分子筛的双重作用。具有电泳和分子筛的双重作用。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺N,N,N-N-甲叉甲叉甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺双丙烯酰胺双丙烯酰胺 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m PAGPAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变改变改变改变 AcrAcrAcrAcr浓度或浓度或浓度或浓度或AcrAcrAcrAcr与与与与BisBisBisBis的比例可以得的比例可以得的比例可以得的比例可以得到到到到不同孔径的凝胶。不同孔径的凝胶。不同孔径的凝胶。不同孔径的凝胶。PAGEPAGEPAGEPAGE分分为为连连续续系系统统和和不不连连续续系系统统两两大大类类。连连连连续续续续系系系系统统统统电电电电泳泳泳泳体体体体系系系系中中中中缓缓冲冲液液pHpH值值与与凝凝胶胶中中的的相相同同.带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下，主主要要靠靠靠靠电电电电荷荷荷荷和和和和分分分分子子子子筛筛筛筛效效效效应应应应。不不不不连连连连续续续续系系系系统统统统中中中中带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应、分分子子筛筛效效应应，还还还还具具具具有有有有浓浓浓浓缩缩缩缩效效效效应应应应，因因而而其其分分离离条条带带清清晰晰度度及及分分辨辨率率均均较较前前者者佳。佳。SDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入是在蛋白质样品中加入SDSSDS和含有巯基乙醇的和含有巯基乙醇的样品处理液，样品处理液，SDSSDSSDSSDS是一种很强的是一种很强的阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂，它，它可以可以断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。级和三级结构。【SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE基本原理基本原理基本原理基本原理】强还原剂巯基乙醇强还原剂巯基乙醇强还原剂巯基乙醇强还原剂巯基乙醇可以可以断开二硫键断开二硫键断开二硫键断开二硫键破坏蛋白质的四级破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与聚后的侧链与SDSSDS充分结合形成带负电荷的充分结合形成带负电荷的蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质-SDS-SDS-SDS-SDS 复合物复合物复合物复合物。蛋白质分子蛋白质分子结合结合结合结合SDSSDSSDSSDS阴离子后，所带负电荷的量远远超阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量。的相对分子质量。的相对分子质量。的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关而与其所带电荷的性质无关。有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的，它们在 SDSSDSSDSSDS和和巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此作用下，解离成亚基或单条肽链，因此 这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的这一类蛋白质，测定的只是亚基或单条肽链的MWMW。将已知分子量的将已知分子量的标准蛋白质标准蛋白质标准蛋白质标准蛋白质在在SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE 中的电泳迁移中的电泳迁移率率对分子量的对数作图对分子量的对数作图对分子量的对数作图对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。率，就能根据标准曲线求得其分子量。当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在17,00017,000165,000165,000之间时，之间时，蛋蛋蛋蛋白质白质白质白质-SDS-SDS-SDS-SDS复合物复合物复合物复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：数呈线性关系：lgMW=K-bmlgMW=K-bmlgMW=K-bmlgMW=K-bm 【操作方法操作方法】、垂直板电泳槽、垂直板电泳槽、垂直板电泳槽、垂直板电泳槽 1 1 1 1）分离胶的制备）分离胶的制备）分离胶的制备）分离胶的制备 配配制制12%12%分分离离胶胶。在在烧烧杯杯中中依依次次加加入入重重蒸蒸水水3.35ml,3.35ml,分分离离胶胶缓缓冲冲液液2.5ml,10%SDS 2.5ml,10%SDS 0.1ml,0.1ml,凝凝胶胶储储备备液液4.0ml4.0ml，10%10%过过硫硫酸酸铵铵50ul50ul和和TEMED TEMED 10ul10ul（两两块块胶胶的的量量？）。由由于于APAP和和TEMEDTEMED相相遇遇后后凝凝胶胶即即开开始始聚聚合合，所所以以应应立立即即混混匀匀混混合合液液，用用移移液液枪枪抽抽取取3.23.5ml凝凝胶胶液液加加至至长长、短短玻玻璃璃板板间间的的窄窄缝缝内内.再再用用注注射射器器在在凝凝胶胶表表面面沿沿短短玻玻璃璃板板边边缘缘轻轻轻轻加加一一层层重重蒸蒸水水,用用于于隔隔绝绝空空气气，使使胶胶面面平平整整。3737烘烘箱箱下下聚聚合合（约约30 30-60min-60min）。待待凝凝胶胶完完全全聚聚合合.将将贮贮槽槽的的蒸蒸馏馏水倒去水倒去 ，用细条滤纸吸去残留的水液，用细条滤纸吸去残留的水液。2 2、凝胶的制备凝胶的制备凝胶的制备凝胶的制备 2 2 2 2）浓缩胶的制备）浓缩胶的制备）浓缩胶的制备）浓缩胶的制备 配配制制3%3%浓浓缩缩胶胶。在在烧烧杯杯中中依依次次加加入入重重蒸蒸水水3.12ml3.12ml,浓浓缩缩胶胶缓缓冲冲液液1.25ml1.25ml,10%SDS,10%SDS 0.05ml0.05ml,凝凝胶胶储储备备液液0.6ml0.6ml，10%10%过过硫硫酸酸铵铵 25ul25ul和和TEMED TEMED 5ul5ul（两两块块胶胶的的量量？）。混混匀匀后后用用注注射射器器加加到到已已聚聚合合的的分分离离胶胶上上方方，直直至至距距离离短短玻玻璃璃板板上上缘缘约约0.5cm0.5cm处处(立立即清洗注射器及针头即清洗注射器及针头)。轻轻轻轻插插入入梳梳齿齿至至浓浓缩缩胶胶内内，避避免免带带入入气气泡泡。约约30min30min后凝胶聚合。后凝胶聚合。2 2、凝胶的制备凝胶的制备凝胶的制备凝胶的制备3 3 3 3、蛋白质样品的处理、蛋白质样品的处理、蛋白质样品的处理、蛋白质样品的处理 1 1 1 1）标准蛋白质样品的处理）标准蛋白质样品的处理）标准蛋白质样品的处理）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶兔磷酸化酶B B MW=97,400 MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 MW=66,200 MW=66,200 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400MW=14,400 开封后，沸水浴中加热开封后，沸水浴中加热3-53-5minmin后上样。后上样。2 2 2 2）样液的准备）样液的准备）样液的准备）样液的准备 用移液枪小心吸取处理好的血清用移液枪小心吸取处理好的血清50ul50ul至至1.5ml1.5ml的离心管中，再加入的离心管中，再加入50ul50ul上样缓冲液，混匀后上样缓冲液，混匀后沸水浴中加热沸水浴中加热3min3min，取出冷却后加样。，取出冷却后加样。Staking gelSeparating gel 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，打开电泳仪开关，设置电压为打开电泳仪开关，设置电压为110V110V，电泳电泳80mins,80mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电泳，关闭电源。泳，关闭电源。5 5 5 5、电泳电泳电泳电泳4 4 4 4、加样、加样、加样、加样 用移液器分别取用移液器分别取10 l l样品液，小心将样品加样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。到凝胶凹形样品槽底部。7 7 7 7、结果处理结果处理结果处理结果处理 量量出出加加样样端端距距细细铜铜丝丝间间的的距距离离(cm)(cm)以以及及各各蛋蛋白白质质样样品品区区带中心与加样端的距离带中心与加样端的距离(cm)(cm)，按下式计算相对迁移率，按下式计算相对迁移率m mR R：相对迁移率相对迁移率m mR R=蛋白质样品迁移距离蛋白质样品迁移距离(cm)(cm)溴酚蓝区带距加样端距离溴酚蓝区带距加样端距离(cm)(cm)6 6 、染色与脱色、染色与脱色、染色与脱色、染色与脱色 电电泳泳结结束束后后，取取下下玻玻板板，在在自自来来水水下下用用特特制制板板撬撬开开短短玻玻璃璃板板，从从凝凝胶胶板板上上切切下下一一角角作作为为加加样样标标记记，在在两两侧侧溴溴酚酚蓝蓝染染料料区区带带中中心心，插插入入细细铜铜丝丝作作为为前前沿沿标标记记。加加入入染染色色液液染染色色60 60 minsmins，再再用用脱脱色色液液脱脱色色，直直至至蛋蛋白白质质区区带带清晰，即可计算相对迁移率。清晰，即可计算相对迁移率。【思考题思考题思考题思考题】1、在上样缓冲液中在上样缓冲液中SDSSDS、巯基乙醇、甘油及溴酚、巯基乙醇、甘油及溴酚兰的作用分别是什么？兰的作用分别是什么？2、在在SDS-PAGESDS-PAGE中中,分离胶中的分离胶中的TEMEDTEMED和和APAP的作用的作用是什么是什么?3、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?