1、实验二 细菌的革兰氏染色法
一、实验目的
1．学习革兰氏染色的原理。
2．掌握革兰氏染色的方法。
二、实验原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂——碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色（紫色）者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色（红色）者为革兰氏
2、阴性菌。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
三、实验器材
1．菌种：大肠杆菌、葡萄球菌。
2．试剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥氏（Lugol）)碘液、95%乙醇、0.5%番红染色液。
3．器材及其它：显微
3、镜、载玻片、酒精灯、接种环、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
四、操作步骤
1．涂片：
斜面菌种：取一块洁净无油的载玻片，滴加一滴无菌水，以无菌操作挑取菌苔少许，在无菌水中涂匀。
菌悬液：用接种环以无菌操作钓取菌液2-3滴，均匀涂抹在洁净无油的载玻片上。
（注意涂片切不可过于浓厚）。
2．干燥：将涂好的玻片于室温下自然干燥。（也可利用酒精灯上方的热空气加热干燥，但要注意以玻片不烫手为宜。）
3．固定：将干燥后的涂片通过酒精灯火焰2-3次，加热国定。
固定的目的：（1）杀死细菌并使其粘附在玻片上（2）增加其对染料的亲和力。
固定的方法：（1）酒精灯火焰加热固定（2）甲醇、乙醇
4、等化学固定。
4．染色
（1）初染：滴加草酸铵结晶紫染色液于涂片上（加量以盖满菌膜为度），染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心冲洗。
（2）媒染：滴加（Lugol）碘液，染1min，水洗。
（3）脱色：用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出液无紫色时，（大概20-30s），立即水洗。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
（4）复染：滴加蕃红，染色2-3min，水洗。
5．干燥：用吸水纸轻轻吸去玻片残留水分，并自然干燥。
6．镜检：干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌（G+）；被染成红色者是革
5、兰氏阴性菌（G-）。
五、注意事项
1．革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。
2．染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
3．选用培养16-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
六、作业
绘出革兰氏染色后菌体形态图，并注明菌名、染色后颜色及放大倍数。
七、思考题
你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
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