食品理化检验-糖类的测定.ppt

,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,糖类的测定,广东药科大学食品科学学院,食品分析,龚玉石,1,学习目标,掌握：,食品中总糖和还原糖的测定原理、测定方法及注意事项,直接滴定法测定还原糖的原理、步骤、试剂亚铁氰化钾和次甲基蓝的作用,高锰酸钾滴定法测定还原糖的原理和方法,2,熟悉：,还原糖的提取分离技术,粗纤维、果胶、淀粉等测定的方法,了解,:,碳水化合物、还原糖的概念和相关知识,测定碳水化合物仪器的正确使用方法,学习目标,3,主要内容,概述,可溶性糖类的测定,淀粉的测定,纤维及果胶的测定,4,糖类化合物是多羟基醛或多羟基酮以及水解后能生成多羟基醛或多羟基酮的化合物。,核糖 2-脱氧核糖 葡萄糖 果糖,概述,定义,5,按分子大小分,单糖 葡萄糖、果糖等,低聚糖,210,个单糖，蔗糖、,麦芽糖等,多糖,10,个单糖，如淀粉、,纤维素、果胶等,糖的种类,6,7,8,9,食品主要质量指标,标志着食物的热量,食品中的风味物质（质构、形态、口感、物化性质等）,食品工业生产中重要控制参数和指标,食品中糖类物质测定意义,10,直接法：,根据糖类物质的理化性质作为分析原理制定的各种分析方法。,间接法：,根据已知食品的组成，扣除测定的水分、蛋白质、粗脂肪、总灰分等含量以后，利用差减法计算出来的，通常以无氮抽提物或总碳水化合物来表示。,食品中糖类物质的测定方法,总碳水化合物（,100%,）,=100-,（蛋白质,+,脂肪,+,水分,+,灰分）,11,相对密度法,折光法,旋光法,物理法,化学法,色谱法,重量法,酶 法,-,半乳糖脱氢酶,酶法,葡萄糖氧化酶,测定果胶、膳食纤维,直接法,12,可溶性糖类的提取和澄清,还原糖的测定,蔗糖的测定,总糖的测定,可溶性糖类的测定,13,测定糖的一般程序,提取,纯化,排出干扰物质,测定,14,可溶性糖的提取,提取的目的,：,将被测组分（可溶性糖）提取完全，非糖成分（干扰组分）尽量排除,常用提取剂：,水（,40-50,）,70%-75%,乙醇溶液,乙醇作提取液适用于含酶多的样品，这样避免糖被酶水解。,15,水作提取剂时注意事项,pro,、氨基酸、多糖、色素干扰，影响过滤时间，所以用水作提取剂应注意：,1,）温度过高：可溶性淀粉及糊精溶出。,2,）酸性样品：用碳酸钙中和，控制在中性。,3,）鲜活产品，先经灭酶：加二氯化汞可防止（二氯化汞可抑制酶活性）,16,除去提取液中存在的干扰物质,可溶性糖的澄清 目的,17,能充分除去干扰物质,不改变被测糖分含量和理化性质,不干扰后面的分析测定,对选用的澄清剂的要求,18,中性醋酸铅（最常用）：,铅离子能与很多离子结合，生成难溶沉淀物，同时吸附部分杂质（蛋白质、单宁、果胶、有机酸等）,不会沉淀样液中的还原糖，室温下不形成铅糖化合物,缺点,：脱色力较差；铅盐有毒,可供选用的澄清剂,特点,19,乙酸锌,亚铁氰化钾,：（,生成氰亚铁酸锌沉淀,),吸附或带去干扰物质，,对除去蛋白质能力强，脱色力差,；适用于色浅，富含蛋白质的样液,硫酸铜,氢氧化钠溶液：,碱性条件下，铜离子可使蛋白质沉淀,可供选用的澄清剂,20,可供选用的澄清剂,碱性乙酸铅：,澄清能力强，可除去胶质、蛋白质、色素、单宁等大分子物质，,沉淀颗粒大，可带走果糖，,适用于深色糖浆、废糖蜜等,氢氧化铝（铝乳）：,凝聚胶体,活性炭：,吸附能力强、适用深色溶液的脱色，对糖的损失较大，不常用,21,22,23,葡萄糖 果糖,还原糖的测定,还原糖是指具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离的半缩醛羟基的双糖都具有还原性。,还原糖（还原剂）,+,氧化剂产物,还原糖的测定是糖类定量的基础,24,还原糖的测定方法,碱性铜盐法,铁氰化钾法,碘量法,比色法,酶法,直接滴定法,高锰酸钾法,萨氏法,蓝,-,爱农法,25,斐林氏试剂：,甲液,含,CuSO,4,、次甲基蓝,乙液,含酒石酸钾钠、氢氧化钠、,亚铁氰化钾,临用时吸取等量混合,总的原理：,Cu,2+,Cu,+,Cu,2,O,碱性铜盐法,26,直接滴定法原理,天蓝色,深蓝色,27,指示剂：,次甲基蓝,28,直接滴定法原理,氧化型,蓝色,还原型,无色,29,原理：,将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。根据样液消耗量可计算还原糖含量。,直接滴定法,30,适用范围及特点,是在蓝,-,爱农容量法基础上发展起来的,国家标准分析方法，适用于各类食品,酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性,特点：,试剂用量少，操作和计算都比较简便、快,速，滴定终点明显,GB/T 5009.7-2008,食品中还原糖的测定,31,碱性酒石酸铜溶液的标定,样品溶液预测,样品处理,测定步骤,样品溶液测定,32,样品处理,如乳制品，加水溶解，移入,250 ml,容量瓶中，慢慢加入,5 ml,乙酸锌的溶液和,5ml,亚铁氰化钾溶液,，加水至刻度，摇匀后静至,30,分钟。用干燥滤纸过滤，弃初滤液，收集滤液备用。,33,碱性酒石酸铜溶液的标定,准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各,5ml,，置于,250ml,锥形瓶中，加水,10ml,，加玻璃珠,2,粒。,用已知浓度的还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液，计算还原糖因数。,34,从滴定管滴加约,9ml,葡萄糖标准溶液，加热使其在,2,分钟内沸腾，准确沸腾,30,秒，趁热以每,2,秒一滴的速度滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作,3,次，取其平均值。,碱性酒石酸铜溶液的标定,35,m,1,10mL,碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各,5mL,）相当于葡萄糖的质量，,mg,；,c,葡萄糖标准溶液的浓度，,mg/mL,；,V,标定时消耗葡萄糖标准溶液的体积，,mL,。,计算公式如下：,36,样品溶液预测,其余操作同标定，只是用样品溶液来滴定。,预测目的：,了解样品溶液的糖浓度，确定正式滴定前是稀释还是反滴定。,37,若样品过浓，需稀释后再滴定,稀释倍数的确定：标定和预测体积之比,怎样稀释？,若样品过稀，需反滴定,怎样反滴定？标定那一步，把,10ml,水和,9ml,标液不加，用,10ml,样液代替，然后用标液来滴，与标定时所消耗的标液之差值里面所含的还原糖就是,10ml,样液中所含的葡萄糖。,样品溶液测定,38,说明与讨论,醋酸锌及亚铁氰化钾沉淀蛋白质,测得的是总还原糖量（包括醛糖和酮糖）,本法,Cu,2,+,是,定量基础，所以不能用铜盐作为澄清剂,39,次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下氧化能力比,Cu,2+,弱,说明与讨论,碱性酒石酸铜乙液中少量亚铁氰化钾，可以与,Cu,2,O,生成可溶性的无色络合物，不析出红色沉淀，可消除干扰，其反应如下：,Cu,2,O+K,4,Fe(CN)+H,2,O,K,2,Cu,2,Fe(CN),6,+2KOH,40,滴定必须在沸腾条件下进行：,一是加快还原糖与,Cu,2+,的反应速度；二是可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。,碱性酒石酸铜甲液和乙液用时才混合，否则在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀。,说明与讨论,41,样品溶液预测的目的：,本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求（,0.1%,左右），测定时样品溶液的消耗体积,应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整。,说明与讨论,42,通过预测可知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少,1ml,左右的样液，只留下,1mL,左右样液在后续滴定时加入，以保证在,1,分钟内完成续滴定工作，提高测定的准确度。,43,影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度、煮沸时间和滴定速度。,滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防空气进入反应液中。,说明与讨论,44,高锰酸钾滴定法（贝尔德蓝,Bertrand,法）,原理,45,46,FeSO,4,高锰酸钾滴定法,至,微红色,47,还原糖,+,碱性铜试剂（斐林试剂）,Cu,2,O(,沉淀,),过滤（垂融坩埚）洗涤（热水，,60,）,溶解（酸性硫酸铁溶液）,Fe,2+,（与,Cu,2+,等当量）,Fe,3+,（用,KMnO,4,标准溶液滴定生成的Fe,2+,，根据消耗的,ml,数，计算,Cu,2,O,量）,(,一定量,),(,过量,),(,一定量,),(,过量,),高锰酸钾滴定法,至,微红色,48,适用范围及特点,国家标准分析方法（,GB/T 5009.7-2008,中第二法）,方法的准确度和重现性都优于直接滴定法,适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液也不受限制,但操作复杂、费时，需使用专用的检索表,49,本法所用的碱性酒石酸铜溶液配制方法与直接滴定法不同。,本法以测定过程中产生的的,Fe,2+,为计算依据，因此，在样品处理时，不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作为澄清剂，以免引入,Fe,2+,。,所用碱性酒石酸铜溶液是过量的，即保证把所有的还原糖全部氧化后，还有过剩的,Cu,2+,存在。所以，煮沸后的反应液应呈蓝色（酒石酸钾钠铜络离子）。如不呈蓝色，说明样液含糖浓度过高，应调整样液浓度。,说明与讨论,50,测定必须控制好热源强度，保证在,4min,内加热至沸，否则误差大,过滤和洗涤,Cu,2,O,时，要使其始终在液面以下,生成的,Cu,2,O,用,60,热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不呈碱性为止,还原糖与碱性酒石酸铜溶液的反应过程十分复杂，因此，不能根据生成的,Cu,2,O,量按反应式直接计算出还原糖含量，而需利用经验检索表,说明与讨论,51,如果,Cu,2,O(,沉淀,),过滤,洗涤 干燥 称重,（直接得出,Cu,2,O,的质量称为门森,瓦尔格（,Munson,Walker,）法，称重（质量）,被认为是准确度最高的方法，但操作十分费时。,门森,瓦尔格（,Munson,Walker,）法,52,萨氏法,53,萨氏法,测定,溶液变为淡黄色时，加入淀粉指示剂,滴定终点，蓝色变为微绿色,54,萨氏试剂,71g,磷酸氢二钠,、,40g,酒石酸钾钠,溶于约,400ml,水中。加入,1mol/L,氢氧化钠,溶液,100ml,。把,8g,硫酸铜,溶于水并稀释到,80,毫升，边搅拌边加入到上述溶液中。再取,410g,硫酸钠,溶于水中，加入到上述溶液中，再加入,1/6mol/L,KIO,3,溶液,25ml,，加水稀释到,1000ml放置数天后，用微孔玻璃漏斗过滤，备用。,55,由于萨氏试剂的碱度降低，可提高还原糖的还原当量，可测出微量的还原糖（,0.015,3mg,）。,碘化钾不加在萨氏试剂中，临用前再加入，防止,Cu,2,O,沉淀溶解，增加与氧气的接触机会，使其再被氧化。,淀粉指示剂不宜加入过早，否则淀粉吸附其他物质，不能达到滴定终点，,说明,56,本法所用萨氏试剂也是一种碱性铜盐溶液，与碱性酒石酸铜溶液的不同之处是用,Na,2,HPO,4,代替部分,NaOH,，使试剂碱性较弱。因此不必配成甲、乙液，配成混合溶液也可保存较长时间。,萨氏试剂中的,Na,2,SO,4,的作用是降低反应液中的溶解氧，避免生成的氧化亚铜重新被氧化。,说明,57,还原糖（样品溶液）,+,斐林氏溶液 反应产物,（滴加）,（,Cu,2+,，一定量）,次甲基蓝,蓝,爱农法,用样品试液滴定一定量、煮沸的碱性酒石酸铜溶液，以次甲基蓝为指示剂，达到终点时，稍微过量的样品试液将蓝色的次甲基蓝还原为无色的隐色体，而显出氧化亚铜的鲜红色沉淀。根据试液的用量，查蓝,-,爱农法专用检索表（见附表,7-9,），求得样品中还原糖的含量。,58,斐林氏试剂与高锰酸钾法相同，滴定操作与直接滴定法类似（以甲基蓝为指示剂），但测定过程有严格规定，包括检液浓度，沸腾时间，滴定速度，总测定时间（,3min,之内）等，计算结果用查表法，,终点不易判断，对于初学者不易掌握，故现在大多采用改良法,直接滴定法。,特点,59,还原糖,+,过量的,K,3,Fe(CN),6,=K,4,Fe(CN),6,+,相应的糖酸,剩余的,K,3,Fe(CN),6,+,过量的,KI=I,2,2 Na,2,S,2,O,3,+I,2,=Na,2,S,4,O,6,+2 NaI,淀粉作为指示剂,铁氰化钾法,2K,4,Fe(CN),6,+3ZnSO4=K,2,Zn,3,Fe(CN),6,2,+3K,2,SO,4,硫酸锌，使反应顺利向右进行,60,碘溶液也是一种氧化剂，其氧化能力较弱，仅在碱性条件下与醛糖起反应：,过量的,I,2,用,Na,2,S,2,O,3,溶液滴定求出。,CH,2,OH,CH,2,OH,(CHOH),4,+I,2,+2NaOH,(CHOH),4,+2NaI +2H,2,O,CHO,（一定量，过量）,COOH,（一定量）,碘量法,61,还原糖（或其反应产物）,+,显色剂显色物质,比色测定,其他方法（比色法）,62,葡萄糖或糖类物质 糠醛或糖醛衍生物,（单糖或多糖）,黄至橙色化合物,（用比色法测定）,浓硫酸,苯酚,脱水,酚,-,硫酸法,63,3,，,5,二硝基水杨酸（,DNS,）比色法,分析结果与直接滴定法基本一致,适用于大批样品的测定,64,过氧化物酶,酶,-,比色法,-D-,葡萄糖,D-,葡萄糖酸,内酯,+,H,2,O,2,葡萄糖氧化酶,醌亚胺,（红色）,4-,氨基安替比林,苯酚,505nm,65,蔗糖属非还原性双糖，但可水解为一个,葡萄糖和一个果糖,，称为转化糖，可用,还原糖法,测定。,对于纯度较高的蔗糖溶液，也可用相对密度法、折光法，旋光法等物理法测定。,蔗糖的测定,66,盐酸水解法,原理,样品脱脂后，用水或乙醇提取，提取液经澄清处理以除去蛋白质等杂质，再用盐酸进行水解，使蔗糖转化为还原糖。然后按还原糖测定方法,分别测定水解前后样品液中还原糖含量，两者差值,即为由蔗糖水解产生的还原糖量，乘以一个换算系数即为蔗糖含量。,67,C,12,H,22,O,11,+H,2,O 2C,6,H,12,O,6,（蔗糖，,342,）（转化糖，,360,）,故由转化糖的含量换算成蔗糖含量时，应乘以系数：,342/360=0.95,盐酸水解法（,GB/T5009.8,）,68,盐酸水解法,按还原糖测定方法测定,或高锰酸钾法,69,-D-,果糖苷酶,-FS,过氧化氢酶,葡萄糖氧化酶,(GOD),酶,比色法,葡萄糖酸,+H,2,O,2,有色物质,(,比色测定,),详见,GB/T16286-1996,，用专用试剂盒，高选择性。,蔗糖,+H,2,O,葡萄糖,+,果糖,4-,氨基安替比林,苯酚,70,总糖的测定,总糖通常是指具有还原性的糖,(,葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等,),和在测定条件下能水解为还原性单糖的蔗糖的总量。,滴定法,测定方法 蒽酮比色法,苯酚,-,硫酸法,以还原糖的测定为基础,反应可溶性单糖和低聚糖的总量,71,滴定法,72,蒽酮比色法,73,淀粉的测定,与碘有呈色反应（是碘量法的专属指示剂）,74,淀粉的作用,稳定剂,雪糕、冷饮食品,增稠剂,肉罐头,胶体生成剂,保湿剂,乳化剂,粘合剂,填充料,糖果,淀粉的测定方法,酸水解法,酶水解法,旋光法,75,（,C,6,H,10,0,5,）,n,+nH,2,O nC,6,H,12,O,6,162 180,酸水解法,按还原糖法得出葡萄糖总量后，乘以系数,162/180=0.9,后，即为淀粉含量。,本法适用范围：,淀粉含量较高，半纤维素、果胶、多缩戊糖等其他多糖成分较少的样品。,盐酸,原理：,乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖,76,酶水解法,酸解,液化,淀粉酶水解,有选择性,葡萄糖,糊精、麦芽糖,淀粉,-,淀粉酶、,-,淀粉酶,淀粉糊化,破坏晶格结构，使其易被淀粉酶作用。,液化：,通过淀粉酶的作用，使已糊化过的淀粉液粘度降低。,77,适用范围及特点,淀粉酶有严格的选择性、只水解淀粉,不受半纤维素、多缩戊糖、果胶质等多糖的干扰，适合于这类多糖含量高的样品,分析结果准确可靠，但操作复杂费时,酶水解法,78,直链淀粉含量比例的测定,原理：,直链淀粉与碘溶液形成深蓝色复合物，支链淀粉则生成棕红色复合物,，在淀粉总量一定，改变直链,支链淀粉的比例，可制成由深蓝到紫红的一系列颜色，在,620nm,测吸光度制作标准曲线，可得出样品中直链淀粉的质量分数,。,79,淀粉,化度的测定,淀粉的,化度也叫糊化程度，即食植物性食品（方便面）有此指标。,化的淀粉（已糊化淀粉）,淀粉酶,还原糖,生淀粉（未糊化淀粉）,淀粉酶,还原糖,淀粉化度,=,化的淀,粉/,总的淀粉量,80,粗纤维的测定,纤维素、半纤维素、木质素,等多种组分的混合物，常指不被稀酸、稀碱所溶解的一类物质。,膳食纤维,指不被人的消化系统所消化、分解、吸收的一类物质，包括,纤维素、半纤维素、木质素、戊聚糖、果胶、树胶,等。,81,膳食纤维 按分析方法分类,纤维素、半纤维素和木质素等,果胶、海藻酸钠等,82,粗纤维的测定（称量法）,原理：,稀硫酸水解糖、淀粉,NaOH,蛋白质水解、脂肪皂化,乙醇、乙醚单宁、色素、脂肪,灰化无机成分,残留物（或灰化损失的质量）,粗纤维,83,不溶性膳食纤维的测定,原理：,热的中性洗涤剂除去糖、蛋白质、淀,粉、果胶等物质,淀粉酶除去结合态淀粉,水、丙酮除去脂肪、色素,灰化无机成分,残留物（或灰化损失的质量）,粗纤维,中性洗涤剂：,四硼酸钠、,EDTA,、,十二烷基硫酸钠、,磷酸氢二钾、,pH7,纤维素、半纤维素、木质素,84,酶,-,重量法膳食纤维的测定,原理,样品分别用淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解，除去蛋白质和可消化淀粉后用重量法测定膳食纤维,淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶,85,结构,主链,D,吡喃半乳糖醛酸以,-1,，,4,苷键相连，通常以部分甲酯化存在，即果胶。,-D-,半乳糖醛酸基,-1,4,糖苷键,果胶物质的测定,86,原果胶,：,高度甲酯化,果胶,：,部分甲酯化,果胶酸,：,不含甲酯基,高甲氧基果胶,(HM),：,DE50%,低甲氧基果胶,(LM),：,DE50%,酯化度,(DE),：,D-,半乳糖醛酸残基的酯化数占,D-,半乳糖醛酸残基总数的百分数。,以酯化度分类,87,凝胶性,果酱、果冻等；,增稠、乳化作用,果汁,（防止沉淀、稳定作用）,润滑、吸水、持水功能,与金属离子生成沉淀,分子中的甲氧基，在酶的作用下（酵母）可生成甲醇（劣质果酒）,果胶在食品加工中的应用,88,称量法,70%,乙醇沉淀果胶,乙醇、乙醚洗涤除可溶性糖、色素、脂肪,酸、水提取残渣中总果胶、水溶性果胶,烘干,称重,果胶,果胶酸钠,果胶酸,果胶酸钙,皂化,醋酸,CaCl,2,89,咔唑比色法,原理：,果胶经水解生成半乳糖醛酸，在强酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，用比色法测定，结果以半乳糖醛酸计表示果胶物质的含量。,90,纸层析,薄层层析,气相色谱,高效液相色谱,离子色谱,电泳层析,可溶性糖的分离与定量,91,衍生为具有挥发性的物质,GC,测定,三氯硅烷衍生物,常用的衍生物,三氟乙酰衍生物,乙酰衍生物,甲基衍生物,气相色谱法,最常用,92,气相色谱法,93,94,思考题,可溶性糖提取液澄清剂的种类及各自的特点（优缺点,),直接滴定法测定还原糖的原理、步骤、注意事项、乙液中亚铁氰化钾和甲液中次甲基蓝的作用,高锰酸钾滴定法测定还原糖的原理和方法,蔗糖测定原理、方法及注意事项,粗纤维、果胶、淀粉测定原理,95,