8-人工种子.pptx

書式設定,第,2,第,3,第,4,第,5,第,6,第,7,第,8,第,9,2019/11/4,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,#,書式設定,人工种子,体细胞胚的发生和人工种子制作,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,种子,seed,裸子植物和被子植物特有的繁殖体,由,胚珠,经过传粉受精形成,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,种子结构,种皮,保护作用,胚乳,为发育中的胚提供营养,胚,发育成新的植物体,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,单子叶植物种子结构,子叶,上胚轴,胚根,胚乳,人工种子的定义,别名：合成种子、人造种子、无性种子、种子类似物,将植物离体培养中产生的胚状体（体胚）或者能发育成完整植株的分生组织（不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织等），包裹在有养分和具有保护功能的物质中形成的类似于天然植物种子的结构，并在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,人工种子结构,最外面一层是,人工种皮,人造的化合物，维持胚状体正常发育,透水透气、固定成型、耐机械冲击,中间是,人工胚乳,营养成份和生长调节剂,种子内面则是被包埋的,胚状体,或类似物,具生命的物质结构，发育成植物体,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,半夏人工种子,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,概念的提出1978,年，加拿大，第四届国际植物组织培养会议,利用植物组织培养中具有体细胞胚胎发生的特点,著名的植物组培专家,Murashige,首次提出“人工种子”的概念,人工种子具有巨大的应用潜力，引起了各个国家的高度重视，列入高技术发展计划,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,种子,导弹,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,一、为什么要进行人工种子研究？,人工种子不仅能像天然种子一样可以贮存、运输、播种、萌发和成长为正常植株,人工种子技术有着诱人的前景,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,第一，培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的影响，且具有省地、省工、可直接在田间播种等优点,第二，在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，使长成的植株具备优良特性,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,第三，用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率,第四，一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,1,生产不受自然条件的限制和土地的制约,天然种子在农业生产上受季节限制,一般,1,年只能繁殖,1-2,次,人工种子可在实验室内大量生产，不受限制,一个体积为,12L,的发酵罐在二十天内可生产,1000,万粒人工种子,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,2,快捷高效的繁殖方式，缩短育种时间,一个新的水稻品种用常规方法培育需要七到八年时间,而用人工种子与常规育种结合良种繁育技术减少了移栽驯化过程，只需三四年时间,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,3,人为赋予种子多种优良品质,在人工种子的制作过程中，可以加入某些农药、有益微生物或生长调节物质，人为地控制植物的生长发育，播种后生长出来的植物就有一定的抗逆性,通过转基因技术，使离体培养的“胚”具有优良特性,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4,固定杂种优势,天然种子是有性繁殖获得的，在遗传上具有因减数分裂引起的遗传重组分离现象,杂种优势只能体现在,F,1,代，而,F,2,代便参差不齐了,人工种子属于无性繁殖范畴，可以保持杂种优势,对于一些自然繁殖困难的名贵品种，也可通过人工种子进行快速大量繁殖,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,植物人工种子技术内容,体细胞胚的诱导,体细胞胚发生的同步控制,人工种子的包,裹,人工种子的,储存和萌发,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,二、体细胞胚的诱导,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,1.,体细胞胚的概念,由孢子体或配子体的细胞通过无性繁殖产生的一种类似于合子胚的结构,主要指在组织和细胞培养过程中，起源于非合子细胞（体细胞）并经过多次分裂产生的一种与胚相似的结构,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,2,体细胞胚的特点,组织培养或细胞培养的产物,起源于体细胞（非合子细胞），区别于由卵和精子受精形成的合子胚,具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构,发育过程与合子胚相同,原胚心形胚鱼雷形胚具子叶的成熟胚,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,拟南芥植物野生型的胚胎发育阶段,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,心形胚,鱼雷形胚,成熟胚,原胚,芒果体胚发生由球型胚,(A),，心型胚,(B),，进入鱼雷胚,(C),，萌芽,(D),至植株再生,(E),情形,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,3,体细胞胚来源,1958,年，,Reinert,在胡萝卜的组织培养中最早发现了体细胞胚,至今已从,43,科，,92,属，,100,种以上植物中获得了体细胞胚,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,3-1,从器官上发生,离体培养的器官在一定条件下可以从外植体上直接产生胚状体,器官外植体的表皮细胞,外植体内部的薄壁细胞,子叶和下胚轴,：最容易诱导体细胞胚发生,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,3-2,从愈伤组织上发生,最常见的方式,离体器官,愈伤组织,胚状体,脱分化 分化,能产生胚状体的愈伤组织：胚性愈伤组织,多数来自,callus,的表面细胞：玉米、西洋参,少数来自,callus,的内部：猕猴桃,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,体胚原始细胞的特点,原生质较浓,细胞核显著增大、位于细胞质的中央,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,原始细胞,顶端细胞,基 细胞,原胚,体胚,胚柄,3-3,从游离的单细胞发生,体细胞,分离的原生质体,小孢子等,在胡萝卜上研究较多,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,单离细胞,小细胞,薄壁细胞,退化,原胚,心脏形胚,大细胞,丝状细胞,体细胞胚,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,制作人工种子的核心,保证人工种子具有发芽力及转换为正常植株,体胚的诱导,获得高质量的体胚,要求体胚发育完整、生长健壮,在无菌试管培养条件下，有,90%,以上的体胚能正常,萌发并转换,为完整小植株,体胚转换过程,1,萌发（胚轴的伸长）,2,旺盛的根系发育,3,苗端的生长与发育,4,产生两片以上真叶,5,有正常表现型的绿色植株,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4,影响体胚发生和发育的因素,胚状体的诱导和发生是一个十分复杂的过程,大量研究：形态学、细胞学、生理学和分子生物学等不同的角度,其机理至今仍不清楚，亟需解决,植物材料的内在因素和组织培养的外部条件,影响胚状体的发生和发育,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4-1,供体植物的基因型,a,不同物种产生胚状体的能力不同,茄科植物,矮牵牛：容易产生胚状体,烟草：很少产生，一般通过根芽的分化形成再生植株,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,b,同一物种的不同品种之间产生胚状体的能力也不同,水稻的,11,个品系,1,个品系的,callus,能产生胚状体,紫狼尾草的,21,个品系,19,个品系产生胚状体,2,个品系不能形成,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4-2,外植体的来源,大多数植物只有,处于一定发育阶段的某一种器官,的外植体能产生胚状体,双子叶植物：下胚轴和子叶,禾谷类：幼胚的盾片和幼穗,大黍：结构已发育完全但尚未伸展的黄绿色幼叶才能产生胚性愈伤组织,长春藤：成熟的茎段,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,芹菜、人参、葡萄、甘蔗的组织培养,离体产生的胚状体可以再次作为外植体,，经继代培养能够产生大量的次级和三级胚状体,利用胚状体进行连续培养快速繁殖种苗,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,在继代培养过程中，胚状体的发生能力会逐渐降低,染色体发生倍性改变和畸变,例外：柑橘的,callus,分化胚状体的能力能保持,8,年以上,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,不同植物,callus,分化胚状体的速度不同,咖啡：,70,天,人参：,8,个月,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4-3,培养物的生理状况,培养细胞的内源激素水平,不同采样时期的外植体,采用增殖能力较强的外植体,获得较多的体细胞胚,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4-4,培养物的倍性,体细胞胚可以从不同倍性的组织中获得,单倍性的小孢子（花粉）,二倍体、三倍体、多倍体体细胞,倍性水平不影响体细胞胚的发生,但体细胞胚的发育和转换过程会有差异,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4-5,培养基中的外源激素,根据不同植物对外源激素的需求分,3,种情况,全过程不需要外源激素,添加少量会提高诱导频率,诱导胚状体的全过程需要外源激素,较高的激动素和生长素的配比才有较高的频率（咖啡）,前期需要激素，后期不需要或极低浓度即可,常见，激素诱导出后,callus,，诱导胚状体无需激素（或很低）,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,生长素,auxin,在不少植物中已被证明是胚胎发育所必须的,2,4-D,是诱导多种植物离体培养的体细胞转变成胚性细胞的重要激素，其次是,NAA,据,Evans,等分析有,57.7%,的双子叶植物和所有的单子叶植物在其体细胞胚胎发生的诱导阶段都使用,2,4-D,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,2,4-D,绝大多数研究证明：极为重要的诱导因子,外植体细胞脱分化,愈伤组织脱分化,愈伤组织诱导,胚性细胞的形成,单子叶植物要求浓度较高：,0.5mg,5mg/L,双子叶植物要求浓度较低：,0.02mg1mg/L,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,不同植物的体胚发生，要求不同的激素种类,颠茄：,NAA,和激动素,南瓜：,NAA,和,IBA,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,细胞分裂素,CTK,裸子植物，,CTK,的作用比生长素更重要，特别有利于子叶的发育,添加生长素可提高体细胞胚的发生频率,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,玉米素,一种天然的细胞分裂素,促进胡萝卜体胚的发生,猕猴桃的胚乳,callus,只有在培养基中添加玉米素才能分化出体胚,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,其他激素,ABA,（脱落酸）,生长抑制剂,抑制次级胚和不正常胚的产生并促进正常胚的发育和成熟,GA3,（赤霉素）,促进生长的激素，多数植物不需要,在诱导胚胎发生的时候起抑制作用,能解除花菱草体细胞胚的休眠,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4-6,培养基成分对体胚形成的影响,还原态的氮,（铵盐）的浓度直接影响胚状体的诱导效果,MS,培养基,White,培养基,故：,MS,培养基比,White,培养基对胚状体的形成有更好的效果,培养基中添加,有机氮源,（水解酪蛋白、氨基酸）有利于胚状体的发生,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,氮,N,源,碳水化合物能维持组织培养中外植体的,渗透压,，同时又作为体胚发育的,能源,其种类和浓度可以影响体胚的生长发育,苹果叶片离体培养时，在保证,C,源供应的前提下，降低蔗糖浓度有利于体胚发生,高浓度的葡萄糖（,6-10%,）有利于胡萝卜的体胚发育,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,碳,C,源,椰子乳,被认为是对体胚发生最有效的物质,液体胚乳，对胚的生长发育有明显的促进作用,其它未成熟的胚乳,玉米胚乳、水稻胚乳、小麦胚乳,对胚的生长也有一定作用,酵母、麦芽、酪蛋白等提取物对促进体胚的产生和发育，都是较为有效的天然物质,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,天然提取物,吸附一些外植体分泌出的有毒物质,提高体胚的诱导频率和生长发育,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,活性炭,4-7,环境因子,光照,烟草体胚发生需要高强度的光照,胡萝卜：完全黑暗也可完成,高强的白光、蓝光抑制胡萝卜体胚发生和生长,蓝光可促进心形胚中,ABA(,脱落酸,),的合成,红光促进心形胚的发育,远红光的短时间照射可以促进体细胞胚的发生,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,光照,温度,研究不多,在花粉胚的诱导培养中被证明是有效的,在柑橘属,callus,诱导培养中，随着培养温度的下降胚胎发生能力下降,对花菱草体细胞胚的冷处理可以部分解除其休眠状态,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,温度,体胚的培养可以从液体到半固体范围内进行,一般认为：培养器的种类、胚在培养基中的状态（浸入或漂浮）和培养基的物理状态（半固体或液体，通气性）对胚的形成和发育影响很小,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,培养基状态,培养器的种类,三、体细胞胚发生的同步控制,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,为什么要进行同步控制？,体胚发生的不同步性是普遍现象,在同一外植体上有不同发育时期的体胚,对于研究体胚的分化机制和生化调控带来麻烦,不利于人工种子的制作和生产,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,如何进行同步控制,同步脱分化促进细胞的同步分裂,分离过筛,在悬浮培养中控制通气,利用渗透压控制胚的同步生长,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,1.,同步脱分化,在细胞培养初期加入,DNA,合成抑制剂,（,5,氨基尿嘧啶），使其暂停,DNA,合成,12,24h,处理,除去抑制剂后细胞开始进入同步分裂,1016h,，细胞出现有丝分裂高峰,低温处理抑制细胞分裂，然后把温度提高到正常水平，亦能达到部分同步化的目的,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,2.,分离过筛,根据,体细胞胚发育的各个阶段细胞大小不同,，利用尼龙筛过滤或密度梯度离心法获得大小均一的胚性细胞团，转移到无生长素的培养基上培养,重复几次过滤、培养、再过滤，,90,%,的胚状体能同步发育，达到成熟阶段,该方法较实用、快速，是同步化控制中最常使用的手段,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,采用不同目数的滤网收集体细胞胚，如对云南大叶茶体细胞胚进行筛选,620,目之间可收集到较大的子叶分化期体细胞胚,20-40,目为长梨形或鱼雷形胚,4070,目为心形和球形胚,7o100,目为球形胚,100150,目为多细胞团块,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,网孔目数指的是每平方厘米,(cm2),丝网所具有的网孔数目,将心形胚、鱼雷形胚及鱼雷形偏后期胚转入液体生长培养基中进行培养，,50 d,内就发育成熟,而球形胚需再转入分化培养基中进一步分化,100150,目的多细胞团块则不能在液体生长培养基中分化,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,3.,在悬浮培养中控制通气,在烟草的组织培养中，,乙烯,的产生与细胞生长有密切的关系,在细胞生长达到高峰前有一个乙烯合成高峰,可通过乙烯来控制,每隔,10,或,20h,通入乙烯到培养基中（,3-4s,）,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4.,利用渗透压控制,不同发育阶段的体胚具有不同的渗透压,球形胚：,17.5%,心形胚：,12.5%,鱼雷形胚：,8.5%,成熟胚：,0.5%,通过改变培养基的渗透压使其停留于某一阶段，然后通过降低蔗糖浓度，是胚状体进入同步发育的状态,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,四、人工种子的包裹,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬lbhuang,1,人工种子的基本要求,要有健壮的具有高转换率的体胚,对包裹材料的要求,对体胚无损伤、无毒性,经得起在储藏、运输和种植过程中的一般操作,人工种子中应含有易释放的养分和发育调节剂,价廉物美、适合农业机械化播种,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,用于生产人工种子的植物,具有坚实组培工艺基础的作物（已具备能生产高质量体胚的实验体系）,苜蓿、胡萝卜、香菜等,具有强大商业基础及工艺基础的作物,芹菜、莴苣、番茄、玉米等,一般来讲，农业、林业及园艺上大面积推广的优良作物品系、优质蔬菜、名贵药材等都可作为对象,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,2,人工胚乳,在自然种子中，作为合子胚发育而存在的营养仓库,胚乳,人工胚乳的目的也是要通过各种必需物质的组合为体胚创造出一个微小的含有胶质的营养成份环境，为体胚转换时提供物质营养,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,糖类,既可以作为繁殖体生长的碳源物质，叉可以改变包被体系中的渗透势，防止营养成分外泄，还能在人工种子低温储藏过程中起保护作用,目前用于人工胚乳中的糖类主要有蔗糖、麦芽糖、果糖和淀粉等,其中以蔗糖应用最为广泛，促进人工种子转化成苗的效果也相对较好,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,叶志毅等,(2001),制作桑树,(Morus alaba),体细胞胚人工种子时发现，与果糖相比，蔗糖更利于人工种子的发芽和生长,不同蔗糖浓度对人工种子萌发的影响也不同,Adriani,等,(2000),对猕猴桃,(Actinidia deliciosa),不定芽的包被过程中，发现增加蔗糖的浓度可增加其转化率,但也有研究表明蔗糖的作用不及麦芽糖好,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,淀粉,淀粉在人工种子包被中应用也比较广泛,淀粉可以在胶囊中分解，为植物繁殖体的发育提供碳源支持,Redenbaugh,等,(1987),在制作苜蓿体细胞胚人工种子时发现，马铃薯淀粉能代替麦芽糖，使体胚转化率达,35.4%,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,黄绍兴等,(1995),对木薯淀粉研究还发现,淀粉分子多孔状的结构可以改变海藻酸钙胶囊的致密结构，从而增加胶囊的透气性、保水性和吸水性，提高了人工种子的萌发率,在实际操作中，几种碳源成份配合使用也可以达到很好的效果,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,植物生长调节物质,在人工胚乳中加入,BA,、,IAA,、,GA3,、,NAA,、,ABA,等植物生长调节物质,可以促进体细胞胚胚根、胚芽的分化与生长，还可以促进非体细胞胚繁殖体转化成苗,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,Antonietta,等,(1998),包被茶枝柑,(,Citrus,reticulata,),的体细胞胚人工种子，发现在人工胚乳中附加,GA3,能够使其萌发率由,26.7%,提高到,50%,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,在半夏,(,Pinellia ternata,),小块茎人工种子中添加,GA3,和,NAA,可使其较易生根，成活率提高,Saiprasad,等,(2003),包被兰属,(,Orchid,),植物球茎体，附加,BA,（,0.44,mol/L,，,人工合成的细胞分裂素）和,NAA,（,0.54,mol/L,）,，可使其转化成苗率达,100%,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,金属离子,Ca,2+,可以作为很好的海藻酸钠的离子交换剂，用于人工种子包被中，对繁殖体的萌发与转化不造成影响,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,藻酸盐的水凝胶胶囊系统,在海藻酸钠溶液中加入,MS,或,White,等培养基的大量元素、微量元素、有机物质等基本成分，将它们混合制成胶囊丸,为了促进体胚的生长，在人工胚乳中也加入促进胚根、胚芽生长的植物激素或有益微生物、杀虫剂、除草剂等农用化学药品，人为影响植物的抗逆性,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,3,包裹材料的选择,包裹后胶囊硬度较为合适，且对体胚发育无明显不利影响的,凝胶,海藻酸钠：普遍采用，从海藻中提取的多糖高分子化合物,优点：使用方便、无毒性、价格低廉和具有一定的强度,缺点：“易漏”，水溶性养分容易渗漏，易干,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,涂抹其它材料形成外包膜,1987,年，发现,疏水性物质,Elvax-4260,（乙烯、乙烯基乙配和丙烯酸共聚物）能在一定程度上减少人工种子之间的粘连，并明显减轻蒸发失水，涂抹后的苜蓿人工种子仍可正常发芽,1990,年，,半疏水性膜,操作简便，且能够减少蒸发，对促进胡萝卜种子在土壤的萌发有一定作用，而亲水性外膜无明显效果,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,解决 办法,-1,1993,年，利用,脱乙烯壳聚糖,涂抹海藻酸钠包被的油菜体细胞胚，发芽率达,100%,1994,年，以,1,5%,丙烯酸树脂溶液成膜,10 min,制作的外膜涂抹水稻人工种子效果较佳,1996,年，石蜡能够有效地被烘干并具有一定的对氧的渗透性，用,0.4 mm,的石蜡涂抹包被的细胞团，在空气中（,25,）储存,60 d,仍可达到,90%,的转化率,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,在海藻酸钠胶囊外面,再包被,一层海藻酸钠的方法也能达到与其他涂膜相同的效果,在包被苹果顶芽时，采用两层包被的方法，较一层包被的转化率（,40,）相比可提高到,70,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,添加助剂,添加纤维素衍生物、活性炭和高分子化合物等,1990,年，在胡萝卜人工种子的研究中加入在,MS,培养基中浸泡过的,活性炭,，可以有效地减少营养成分的泄漏,1995,年，在安祖花人工种子中加入,0.1%,的活性炭,，不仅有效控制了营养物质的散失，也使其黄褐化率降低，萌发率和转化率提高,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,解决 办法,-2,在水稻人工种子中添加聚乙烯吡咯啉酮和聚乙烯醇,高分子聚合物,，形成的颗粒粘连少、较分散，且不易失水变形,在海藻酸钠中加入多糖、树胶、高岭土可减慢凝胶脱水速度，并提高了干化胡萝卜体细胞胚的活力,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,两种措施结合使用，可以更好地解决海藻酸钙胶囊的缺陷,1995,年，在安祖花人工种子胚乳中加入,活性炭,并用,酯类共聚物,涂抹使安祖花人工种子在有菌条件下的转化率可达,71.4%,，较只加活性炭（,42.5%,）的情况要高,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,解决 办法,-3,人工种皮软化,另外，海藻酸钠包被的人工种子经低温储藏后，易在表面形成坚硬的外壳而妨碍了人工种子的萌发,KNO,3,可用作海藻酸钠包被人工种子的,软化剂,，,K,+,置换海藻酸钙中的,Ca,2+,以达到软化的效果,2001,年，,Guerra,等用,100,mol/L KNO3,的处理菲约果的人工种子，与用蒸馏水处理的相比提高,81.2%,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,五、,人工种子的,储存和萌发,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,贮藏因农业生产的季节性所限，需要人工种子能贮藏一定时间,但人工种子含水量大，常温下易萌发，易失水干缩，贮藏难度较大,人工种子研究中的主要难点之一,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,人工种子的储藏技术很大程度上依赖于包被技术，不同的包被材料的储藏方法也不同,以,海藻酸钠为包被材料制作的人工种子,为例，介绍人工种子的储藏技术,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,1.,低温储藏技术,在不伤害植物繁殖体的前提下，通过降低温度来降低繁殖体的呼吸作用，使之进入休眠状态,常用的温度一般是,4,储藏时间可达,1-2,个月,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,泡桐的人工种子,4,保存,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,储藏时间,d,体胚 存活率,%,体胚 萌发率,%,30,67.8,43.2,60,53.5,32.4,非体细胞胚人工种子可以在,4,下储藏更长的时间,1999,年，包被濒危植物地宝兰的类原球体，储藏,120 d,后生存能力与储藏前相比无明显变化,马铃薯芽尖用海藻酸钠包被，储藏,270 d,、,360 d,和,390 d,后 萌发率分别是,100%,、,70.8%,和,25%,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,随着低温储存时间的加长，包被体系内的含氧量降低，人工种子萌发率会下降,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang2.,液体石蜡储藏技术,液体石蜡作为经济、无毒稳定的液体物质，常被用来储藏细菌、真菌和植物愈伤组织,研究胡萝卜人工种子的结果表明,短时间保存（,1,个月）能较正常的生长,长时间（,79 d,），则人工种子苗的生长则明显比对照组差,并发现液体石蜡对幼苗的呼吸和光合作用有一定的阻碍作用，达不到所需的效果,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,3.,超低温储藏技术,超低温一般是指,-80,以下的低温,超低温冰箱（,-80,-,-150,）,液氮（,-196,）,在此温度下，植物活细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止,所以，植物繁殖体在超低温过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,目前应用于人工种子超低温保存的方法主要是,预培养,-,干燥法,即人工种子经一定的预处理，并进行干燥，然后浸入液氮保存,经液氮储藏后，可直接在室温下自然解冻,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,1999,年，将蛇麻草离体培养获得的芽尖干燥脱水，经液氮储藏后，室温下解冻,5 min,，恢复率可达,80,，且无表型变异现象,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,4.,植物激素在储存中的作用,脱落酸,(ABA),是一种植物逆境激素，可以诱导产生蛋白质、多胺、脯氨酸和淀粉等物质的增加，使体细胞胚在干燥处理中受到保护,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,Nieves,等,(2001),对甘蔗晚盾片期胚用,ABA,或,JA,（茉莉酸）,处理后进行包被，并在干燥器中用无水硅酸进行干燥处理，使其水含量降至,60,或,30,。,结果发现存活的体细胞胚是由,ABA,处理的胚，而用,JA,处理不能达到此效果,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,抑制植物生长、萌发、促进衰老、提高抗性等生理作,.,对于非体细胞胚人工种子，,Khor,等,(1998),对龙舌兰,(Spathoglottis plicata),原球茎用,l0,-5,M,的,ABA,处理，经干燥脱水与包埋，也可获得极高的存活率。,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,高渗透压,处理可增加植物繁殖体内源,ABA,浓度、诱导休眠，从而增加其耐旱性,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,渗透压对高丽参体胚休眠的影响,蔗糖浓度 （,%,）,能否萌发,ABA,浓度（,ng/g,FW,）,3%,能,258.4,9%,否,487.8,榆叶梧桐,(,Guazuma crinita,),的不定芽经,25%,的甘油，,15%,蔗糖，,15%,的乙烯基乙二醇，,13%,的二甲基亚砜和,2%,的聚乙二醇,(4 000),溶液,(w/v),在,25,处理,15-60min,后储存在液氮中，可得到,80%,的存活率,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,防腐,人工种子大面积田间应用的关键技术之一,人工胚乳中含有糖类等有机物质,目前尚未得到可真正称为人工种皮的包裹材料,暴露于田间的开放系统中，势必会受微生物的侵染而腐烂,在人工种皮中添加一定量的抗生素或防腐剂等能起抑菌作用，萌发率可提高,4-10%,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,人工种子技术展望及存在的 问题,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,目前，科学工作者已制成模式性人工种子的植物十余种，但距离实际应用还有很大距离,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,主要有三大难题有待克服,许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚,现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀,人工种子的贮藏有待进一步完善,上海海洋大学 细胞工程 黄林彬,lbhuang,