果蔬生物防腐研究进展.doc

果蔬生物保鲜研究进展

果蔬采后腐烂损失十分巨大。发达国家为l0%～30%, 发展中国家则高达40%～50%。长久以来果蔬采后防腐保鲜关键依靠化学杀菌剂, 然而, 连续使用化学杀菌剂易使病原真菌产生抗药性, 易造成环境污染, 易危害公众健康。在农作物大田病害生物防治蓬勃发展带动下, 果蔬生物保鲜成为研究热点, 迄今为止, 大家已从苹果、 柑橘、 梨、 桃、 猕猴桃等10余种水果上筛选出几十种拮抗微生物, 但真正能实现商品化应用仅有: 丁香假单胞杆菌(P.syringae)、 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、 季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)等少数多个拮抗微生物。
1生物保鲜微生物种类
生物保鲜最早报道是Tronsmo＆Dennis(1977)利用木霉菌(Trichoderma sp.)控制草莓灰霉病。在已报道拮抗微生物中, 以细菌(bacteria)、 酵母菌(yeast)应用最多。拮抗细菌关键有芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)、 土壤放射杆菌(Agrobacterium radiobacter)等。芽孢杆菌包含枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、 多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、 短小芽孢杆菌(B.pumilis)、 蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、 巨大芽孢杆菌(B.megaterium)等; 假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)关键有荧光假单胞杆菌(P.fluorescens)、 洋葱假单胞杆菌(P.cepecia)和恶臭假单胞菌(P.putide)等。拮抗酵母菌关键有: 季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)、 隐球酵母菌(Cryptococcus sp.)、 罗伦隐球酵母(C. laurentii)、 假丝酵母菌(Candida famata)、 季氏假丝酵母(Candida guilliermondii)、 红酵母菌(Rhodotorula glutinis)、 毕赤氏酵母菌属(Pichia menbranefaciens)、 柠檬形克勒克氏酵母(Kloeckera apiculata)等。
2 作用机理
果蔬采后生物保鲜作用机理关键有抗生、 竞争、 寄生及诱导抗性。
2.1 抗生作用
经过拮抗微生物分泌抗菌素来抑制病原菌。如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)分泌伊枯草菌素; 洋葱假单胞杆菌(P. cepacia)产生吡咯烷酮类抗菌素; 木霉(Trichoderma sp.)产生吡喃酮等[1]。
能够产生抗菌素微生物关键是细菌, 且抗菌素多个多样, 不仅同一个细菌能够产生多个抗菌素, 而且一个抗菌素也可由多个细菌产生。自1945年Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生拮抗物质以来, 大家已从枯草芽孢杆菌不一样菌株中分离出几十种抗菌物质, 这些抗菌物质是一类从简单分子到复杂化合物即从杆菌肽(bacitracin), 大环脂(cycleopetite), 到类似噬菌体颗粒等不一样成份组成物质, 也有一部分低分子量抗菌素、 蛋白性抗菌物质。
细菌素(Bactericin)是另一类抗菌素, 关键成份是蛋白质、 多肽、 核苷酸、 生物碱类。产生细菌素细菌关键有: 土壤放射杆菌(A.radiobacter)、 丁香假单胞菌(P.syringae)、 菊欧氏杆菌(E.chrysanthemi)、 密执安棒形杆菌(Clavibacter michiganesis)、 甘蓝黑腐黄单胞菌(Xanthomonas campestris)等。
木霉菌经过产生木霉素(trichodermin)、 胶霉素(gliotoxin)、 绿木霉素(viridin)、 抗菌肽(peptide antibiotic)等来抑制病害发生。
2.2 竞争作用
指营养物质和生存空间竞争, 在果蔬生物保鲜中, 竞争作用尤为关键[2,3], 因为引发果蔬采后病害病原菌都是非专化性死体营养菌, 其孢子萌发及致病活动需要大量外源养分, 经过与病原真菌竞争果实表面营养物质及侵染位点, 从而降低果蔬表面病原真菌数量。经过拮抗菌和病原菌联合培养试验结果表明: (1)拮抗菌能抑制病原菌孢子萌发和生长 (2)拮抗菌抑制病原菌效果与拮抗菌繁殖体密度显著相关; (3)外加养分, 能够使受到抑制病原菌部分或完全复活。为了抑制病原菌侵染, 拮抗菌必需在病原菌抵达以前或抵达以后很短时间内占据侵染部位。已报道众多酵母菌如季也蒙毕赤酵母、 变黄罗伦隐球酵母、 假丝酵母、 掷孢酵母等都能够在果蔬伤口部位快速繁殖, 其繁殖速度显著快于病原菌, 从而造成病原菌失去了繁殖和生长有效空间。
2.3 寄生作用
以吸附生长、 缠绕、 侵入、 消解等形式抑制病原菌。如拮抗酵母菌分泌胞外水解酶如几丁质酶(chitinases)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanases), 将真菌细胞壁关键成份几丁质和β-1,3-葡聚糖分别降解为几丁质单糖、 二糖和寡糖, 从而破坏病原菌细胞骨架, 表现出显著抗真菌活性[4,5]; 木霉菌经过侵入或穿透寄主菌丝细胞, 产生几丁质酶、 葡聚糖酶(包含β-1,3-, β-1,4-,β-1,6-葡聚糖酶)以及蛋白酶、 脂酶等一系列水解酶类, 以此消解病原菌细胞壁。Castoria[5]等在研究红酵母及隐球酵母对苹果采后病害生防机制时发觉: 展青霉(P. expansum)及灰葡萄孢(Botrytis cinerea)细胞壁都能够诱导红酵母及隐球酵母产生胞外β-1,3-葡聚糖酶。在采后生物保鲜中, 寄生作用被认为作用不太理想, 因为作用缓慢, 往往落后于病原菌对果蔬侵害。另外, 拮抗菌存活与增殖需保持一定病原菌密度, 而果蔬采后生物保鲜, 需完全排除和钝化病原菌[6]。
2.4 诱导抗性
诱导植物抗性是生物保鲜一个关键方面。植物在遭到病原物或非病原物诱导时, 常常经过木质素、 胼胝体和羟脯氨酸糖沉积、 植物抗菌素积累、 蛋白质酶抑制剂和溶菌酶(几丁质酶和脱乙酰几丁质酶等)合成来增强细胞壁抗性, 这些过程包含苯丙氨酸解氨酶(PAL)、 过氧化酶(POD)、 多酚氧化酶(PPO)与超氧化物歧化酶(SOD)等酶活性。拮抗菌诱导植物抗性在G-细菌如假单胞菌和真菌已经有很多报道[7], Lppolito等[8]发觉出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)对苹果β-1,3-葡聚糖酶、 几丁酶和过氧化物酶有显著诱导作用, 范青等[9]发觉季也蒙假丝酵母(C. guilliermondii)和膜醭毕赤酵母(P. membranefaciens)可刺激桃果实伤口几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶产生。拮抗效果与拮抗菌、 病原菌和植物相关, 植物与拮抗菌、 病原菌之间作用包含分子识别、 信号传导和基因表示等一系列过程。假如想对诱导抗性有一个清楚认识, 必需在分子水平上深入了解植物产生诱导抗性生理生化改变和调控基因。
拮抗菌对植物诱导关键产生三方面效果: a 抗病性次生代谢物大量产生 Arras[10]发觉拮抗菌(C.famata)能够诱导柑橘产生植保素和7-羟基-6-甲氧基香豆素(Scopoletin)等抗性物质。b 细胞组织结构发生改变 El-Ghaouth等[11]发觉拮抗菌(C.saitoana)可诱导苹果伤口细胞变形, 产生乳突结构, 抑制病原菌入侵。c 诱导植物产生抗病性 一些酵母菌在果蔬上大量生长, 能够诱导果蔬产生含有抑菌作用物质; 而有些酵母细胞能够诱导果蔬产生几丁酶、 葡聚糖酶及其它酶类, 从而抑制病原菌生长[12]。
3 生物保鲜应用前景
拮抗细菌在离体条件下可产生抗生素类、 酶类和挥发性等成份, 在果蔬生物保鲜中起到关键性作用[13], 如由Bacillus spp.产生多肽类物质对多个植物真菌和细菌病害在活体和离体条件下都表现出很强拮抗活性。范青等[14,15]对枯草芽孢杆菌果蔬生物保鲜开展了深入地研究。伴随研究不停深入, 拮抗细菌产生抗菌素可能诱发病原菌产生抗药性, 对人体健康可能产生不利影响等缺点引发世人警觉。基于这些原因, 对拮抗菌筛选已从产生抗菌素细菌转向了不产生抗菌素酵母菌。如Zahavi等[16]发觉假丝酵母(C.guilliermondii)对葡萄灰葡萄孢霉及黑曲霉引发腐败含有显著抑制效果。范青等[17]发觉该酵母菌对桃果实软腐病含有显著抑制效果。
4 发展趋势
4.1 建立有效拮抗菌筛选方法
从分子水平上揭示果蔬生物保鲜生防机制, 建立快速、 有效离体方法, 筛选更为有效拮抗菌。
4.2 利用遗传工程手段构建新拮抗菌株
因为多数拮抗菌抑菌谱较窄, 构建基因工程菌, 扩大抑菌谱含相关键意义。将胞外水解酶(几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶等)或抗真菌蛋白基因等导人拮抗菌中, 从而提升拮抗菌活性及抑菌谱。如Jone等[18]克隆出杀菌酞A编码基因, 并把它转化入啤酒酵母(Saccharomyces cerevisill)细胞, 啤酒酵母细胞转化体能很好地阻止毛刺盘孢属霉菌(Calletotrichum caccodes)孢子萌发, 有效地阻止了西红柿腐烂。
4.3 添加低剂量化学杀菌剂, 并同多种保鲜方法相结合
拮抗微生物在实际应用中, 会受多种原因影响而降低其对病害防效, 探讨拮抗微生物间、 拮抗微生物与低剂量化学农药混用以及与诱导抗性和采后保鲜处理等方法配合防治效果, 对生物保鲜走向商品化含相关键意义。如Calventz等[19]在研究红酵母对苹果采后青霉菌抑制作用时发觉: 在制备红酵母培养基中添加铁离子, 制备含铁细胞红酵母对霉菌抑制效果强于不含铁细胞红酵母, 田世平、 范青等[20,21]研究发觉: 丝孢酵母菌液与1～2%CaCl2配合可显著提升丝孢酵母对苹果灰霉病和青霉病抑制效果; 丝孢酵母与扑海因(iprodione)配合对苹果采后灰霉病和青霉病抑制效果也显著好于单独使用相同剂量拮抗菌和杀菌剂。McLaughin等[22]研究发觉: 在季也蒙毕赤酵母细胞培养液中加入钙盐能提升这种酵母菌防病效果, 同时可降低该菌使用剂量。也有试验表明, 2-脱氧-D-葡萄糖能够提升掷孢酵母抑制苹果青霉菌效果。为了深入强化生物保鲜效果, 结合保鲜方法, 如将微生物抗菌剂与愈伤和热处理、 紫外线、 改变O2和CO2浓度、 适宜低温等结合, 更有利于提升果蔬生物保鲜功效。

参考文件:
[1] 张维一,毕阳 果蔬采后病害与控制[M].北京:中国农业出版社,1996
[2] Wisniewski, et al, Biological control of post harvest disease of fruits and vegetables: Recent Advances [J]. Holt Science,剂1992,27;94-98
[3] Lima,et al ,Effectiveness of Aureobasidium pullulans and Candida oleophla against postharvest strawberry rots [J] Postharvest Biology Technology, 1997, 10: 169-178
[4] 陈三风,李季伦.几丁质酶研究历史和发展前景[J].微生物学通报,1993,20(3):156-160.
[5] Castoria R ,Curtis F D ,Lima G ,et a1.β-1,3-glucanase activity of two saprophytic yeasts and possible mode of action as biocontrol agents against postharvest diseases [J]. Postharvest Biology and Technology. 1997,12:293-300
[6] Janisewicz,et al. Development of a microbial community of bacterial and yeast antagonists to control wound-invading postharvest of fruits[J] Appl Environ Microbiol, 1995,61:3261-3267
[7] Loon L C, Bakker H M, Pieterse C M J. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria [J]. Ann. Rev. Phytopathol. , 1998, 36: 453-483
[8] Ippolito A. El-Ghaouth A. Control of postharvest decay of apple fruit by Aureobasidium pullulans and induction of defense responses. Postharvest Biology and Technology. , 19: 265-272
[9] 范青,田世平,刘海波,等. 拮抗菌膜醭毕赤酵母和季也蒙假丝酵母产生β-1,3-葡聚糖酶和几丁酶对软腐病菌协同抑制. 科学通报,,.46:1713-1717
[10] Arras G. Mode of action of an isolate of condida famata in biological control of penicillium digitatum in organge fruits. Postharvest Biology and Technology, 1996,8:191-198
[11] El-Ghaouth A. Wilson C L. Winiewski M. Ultrastructural and cytochemical aspects of the biological of Botrytis cinerea by candida saitoana in apple fruit. Biological control 1998, 88: 283-191
[12] 刘海波,田世平.水果采后生物防治拮抗机理研究进展[J].植物学通报,, 18(6):657-664
[13] Trejo-Estrada SR,Paszcaynski A,Crawford DL.1998.Antibiotics and enzymes produced by the biocontrol agent Streptomyces violaceusniger YCED-9.J Indust Microb Biotech,21:81-90
[14] 范青,田世平,李永兴,等.枯草芽孢杆菌(B-912)对桃和油桃褐腐病抑制效果 植物学报, ,42 (11):1137-1143
[15] 范青,田世平,李永兴,等.枯草芽孢杆菌(B-912)对采后柑橘果实青、 绿霉病抑制效果 植物病理学报, (30): 343-348
[16] Zahavi T. Cohen L. Weiss B. et al. biological control of Botrytis, Aspergillus and Rhizopus rots on table and wine grapes in Israel [J]. Postharvest Biology and Technology, , 20: 115-124.
[17] 范青,田世平,徐勇,等.季也蒙假丝酵母对采后桃果实软腐病抑制效果[J].植物学报,,42(10): 1033-1038
[18] Jones R W, Prusky D. Expression of an antifungal peptide in Saccharomyces: A new approach for biological control of the postharvest disease caused by Colletotrichum coccodes [J]. Phytopathology, ,92(1):33-37
[19] Calventz V,Benuzzi D,Tosetti M I. Antagonistic action of siderophores from Rhodotorula glutinis upon the postharvest pathogen Penicilliiium expansum [J].International Biodeterioration and Biodegradation. 1999, 43(4): 167-172
[20] 范青,田世平,徐勇.丝孢酵母对苹果采后灰霉病和青霉病抑制效果影响[J].中国农业科学, ,34(2):163-168
[21] 田世平,范青,徐勇,等. 丝孢酵母Trichosporon sp.与钙和杀菌剂配合对苹果采后病害抑制效果(英) 植物学报, ,43(5):516-523
[22]Mclaughlin R.J,Wisniewski M E,Wilson C L, et al Effect of inoculum and salt solutions on biological control of postharvest diseases of apple with candidsa sp. [J] Phytopathology ,1990,80:456-461.

附件1
“中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨学术研讨会”
论文记录表
论文题目
果蔬生物保鲜研究进展
作者（按贡献分前后排列）
曾顺德 张迎君 武峥
作者单位
重庆市果树研究所
具体摘要

单位意见

8月30日
（盖章）

“中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨学术研讨会”
回执
姓名
曾顺德
性别
男
职务/职称
副研究员
工作单位
重庆市果树研究所
单位地址
重庆 江津 重庆市果树研究所
邮编
402260
联络电话
单位

手机

住宅

E-mail

您对会议提议和要求

注: 回执能够复印, 回执请寄回: 广东省广州市五山路广东省农业科学院果树研究所（510640）:
易干军, 曾继吾（电话: ,0,0,E-mail:, ）