蛋白定量技术.doc

蛋白定量技术

（一）双缩脲测定法
1．原理 蛋白质中肽键有双缩脲反应, 在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色络合物, 在一定范围内, 颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法特异性强, 游离氨基酸、 小肽和核酸均不产生这种反应, 但此法不够敏感, 仅能测出毫克水平。
2．试剂配制
硫酸铜（CuSO4·5H2O） 1.50g
酒石酸钾钠 5.00g
H2O 500.0ml
10％氢氧化钠（不含硫酸钠） 300ml
H2O 加至 1 000ml
此溶液可长久保留, 如产生暗红色沉淀, 则应废弃重配。
3．标准曲线制备
⑴ 正确称取牛血清白蛋白1.0g（必需时须首先采取凯氏定氮法测定牛血清白蛋白制品中实际纯蛋白含量, 然后换算）, 以生理盐水配成1％浓度。
⑵ 将1％牛血清白蛋白按表8-1进行稀释:
表8-1 牛血清白蛋白稀释方法表
成 分
试 管 号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1％蛋白液（ml）
1.0
.09
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
－
蛋白含量（mg）
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
－
生理盐水（ml）
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
双缩脲试剂（ml）
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
试剂蛋白含量（mg）
8.0
7.2
6.4
5.6
4.8
4.0
3.2
2.4
1.6
0.8
0
注: 1％牛血清白蛋白, 经凯氏定氮测定含纯蛋白为80％。
⑶ 混匀后于室温放置0.5h～1h, 光电比色（540nm）, 次序由低浓度至高浓度, 每管测3次, 求其平均值。
⑷ 以OD值为纵坐标, 蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。
4．样品测定
⑴ 取样品0.1ml, 加生理盐水1.4ml。也可将样品做1﹕10稀释加1ml, 再加生理盐水0.5ml。
⑵ 加双缩脲试剂4.0ml, 混匀, 至室温0.5h～1h。
⑶ 另以1.5ml生理盐水加4.0ml双缩脲试剂作为空白对照。
⑷ 测OD540值。
⑸ 依据OD值从标准曲线上查出蛋白含量。
注意: 多种双缩脲试剂配法、 加量及室温静置时间都有差异, 一旦标准曲线制订后, 样品测定则必需与标准曲线制订条件一致, 不然结果有差异。
（二）紫外光谱吸收法
1．原理 本法依据蛋白之中芳香族氨基酸－色氨酸、 酪氨酸在紫外光区吸收特点而建立。蛋白质在280nm波长周围有一吸收峰, 其吸收程度与这些氨基酸含量成正比。此法灵敏度高, 可测到微克水平, 操作简单, 不需要加多种试剂, 测完后, 样品可回收。
2．标准曲线制备
⑴ 用精密天平称取牛血清白蛋白50mg, 溶于50ml生理盐水中。
⑵ 以生理盐水再稀释成每ml含0.1mg、 0.2mg、 0.3mg、 0.4mg……0.9mg, 以盐水对照。
⑶ 测各管OD280值。
⑷ 以OD280值为纵坐标, 蛋白含量为横坐标, 绘制标准曲线。
3．样品测定
将待测样品以盐水合适稀释, 在0.10mg/ml~1.00mg/ml之间, 以生理盐水为对照, 测OD280值, 从标准曲线上查出蛋白含量。
（三）Folin酚法
1．原理 蛋白质中酪氨酸与色氨酸和Folin酚试剂中磷钨酸、 磷钼酸作用后, 在碱性条件下不稳定, 被还原成蓝色化合物（钼蓝）。所以经过比色即可测知标本中蛋白含量。该法优点是操作简单、 灵敏度高, 且不受溶液中脂多糖干扰。
2．试剂
试剂甲:
A液: Na2CO3 10.00g
NaOH 2.00g
酒石酸钾钠（或钾盐钠盐）0.25g
混合、 溶于500ml蒸馏水中。
B液: CuSO4·5H2O 0.5g
H2O 100.00ml
用前将A液50份与B液1份混合即为试剂甲。
试剂乙:
于磨口回流瓶加入下列试剂
Na2WO4·2H2O 100.00g
NaMoO4·2H2O 2500g
H2O 700.00ml
85％H3PO4 50.00ml
浓HCl 100.00ml
按上回流冷凝管以小火回流10h后再加:
硫酸锂 150.00g
H2O 50.00ml
溴水 数滴
开口继续沸腾15min, 驱除过量溴, 冷却后溶液呈黄色微带绿色如仍呈绿色, 须反复滴加液体溴步骤）。稀释至1L, 过滤, 滤液置于棕色瓶保留。使用时用标准NaOH液滴定, 以酚酞为指示剂, 然后合适稀释（加水约1倍）使最终浓度为1mol/L。
3．标准曲线制备
⑴ 取标准牛血清白蛋白2.50mg, 溶于10ml蒸馏水中, 使成250μg/ml。
⑵ 按表8-2稀释。
表8-2 标准曲线稀释方法
成份
试 管 号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
牛血清白蛋白标准品（ml）
0
0.2
0.2
0.4
0.1
0.6
0.6
0.8
0.8
1.0
1.0
生理盐水（ml）
1.0
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0
蛋白含量(μg／ml)
0
50
50
100
100
150
150
200
200
250
250
⑶ 每管加试剂甲5ml, 混合后室温放置10min, 再加0.50ml试剂乙（即Folin酚试剂）, 立刻摇匀（不然显色降低）。
⑷ 30min后测OD650nm。
⑸ 以OD为纵坐标, 蛋白含量为横坐标, 绘制标准曲线。
4．样品测定
⑴ 待测样品1ml（合适稀释至约含25μg－250μg/ml）。
⑵ 加试剂甲、 乙。
⑶ 比色、 测OD650值。
⑷ 查标准曲线, 求蛋白含量乘以稀释倍数, 即为样品蛋白含量。
（四）紫外分光测定法
A1%1cm＝13.8（IgG）(280nm)
A1%1cm＝14.5(IgM)(280nm)
蛋白质浓度（mg/ml）=1.45OD280－0.74OD260 （此为经验公式, 即以不一样浓度蛋白质和核酸混合测定数值所建立）。