微生物生长的检测方法.doc

微生物生长检测方法
　　微生物生长繁殖是其在内外多种环境原因相互作用下综合反应。所以生长繁殖情况就可作为研究多种生理生化和遗传等问题关键指标,同时,微生物在生产实践上多种应用或是对致病,霉腐微生物防治都和她们生长抑制紧密相关。所以有必需介绍一下微生物生长情况检测方法。既然生长意味着原生质含量增加,所以测定方法也都直接或间接以次为依据,而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长衡量,能够从其重量,体积,密度,浓度,做指标来进行衡量。
　　生长量测定法
　　体积测量法(又称测菌丝浓度法)
　　经过测定一定体积培养液中所含菌丝量来反应微生物生长情况.方法是,取一定量待测培养液(如10毫升)放在有刻度离心管中,设定一定离心时间(如5分钟)和转速(如5000 rpm),离心后,倒出上清夜,测出上清夜体积为v,则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长一个关键监测指标.这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致处理条件,不然偏差很大,因为离心沉淀物中夹杂有部分固体营养物,结果会有一定偏差。
　　称干重法
　　可用离心或过滤法测定。通常干重为湿重10-20%。在离心法中,将一定体积待测培养液倒入离心管中,设定一定离心时间和转速,进行离心,并用清水离心洗涤1-5次,进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干,或采取红外线烘干,也可在80℃或40℃下真空干燥,干燥后称重.如用过滤法,丝状真菌可用滤纸过滤,细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤,过滤后用少许水洗涤,在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐,通常获取微生物产品为菌体时,常采取这种方法,如活性干酵母, 部分以微生物菌体为活性物质饲料和肥料。
　　比浊法
　　微生物生长引发培养物混浊度增高。经过紫外分光光度计测定一定波长下吸光值,判定微生物生长情况。对某一培养物内菌体生长作定时跟踪时,可采取一个特制有侧臂三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计比色座孔中,即可随时测定其生长情况,而无须取菌液.该法关键用于发酵工业菌体生长监测。
　　菌丝长度测量法
　　对于丝状真菌和部分放线菌,能够在培养基上测定一定时间内菌丝生长长度,或是利用一只一端开口并带有刻度细玻璃管,到入适宜培养基,卧放,在开口一端接种微生物,一段时间后统计其菌丝生长长度,借此衡量丝状微生物生长。
　　微生物计数法
　　血球计数板法
　　血球计数板是一个有尤其结构刻度和厚度厚玻璃片,玻片上有四条沟和两条嵴,中央有一短横沟和两个平台,两嵴表比两平台表面高0.1 mm,每个平台上刻有不一样规格格网,中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格.经过油镜观察,统计一定大格内微生物数量,即可算出1毫升菌液中所含菌体数.这种方法简便,直观,快捷,但只适宜于单细胞状态微生物或丝状微生物所产生孢子进行计数,而且所得结果是包含死细胞在内总菌数。
　　染色计数法
　　为了填补部分微生物在油镜下不易观察计数,而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞不足,大家发明了染色计数法.借助不一样染料对菌体进行合适染色,能够更方便在显微镜下进行活菌计数.如酵母活细胞计数可用美蓝染色液,染色后在显微镜下观察,活细胞为无色,而死细胞为蓝色。
　　百分比计数法
　　将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度液体与一待测细胞浓度菌液按一定百分比均匀混合,在显微镜视野中数出各自数目,即可得未知菌液细胞浓度。这种计数方法比较粗放.而且需要配制已知颗粒浓度悬液做标准。
　　液体稀释法
　　对未知菌样做连续十倍系列稀释,依据估量数从最适宜三个连续10倍稀释液中各取5毫升试样,接种1毫升到3组共 15只装培养液试管中,经培养后统计每个稀释度出现生长试管数,然后查最大或然数表MPN得出菌样含菌数,依据样品稀释倍数计算出活菌含量.该法常见于食品中微生物检测,比如饮用水和牛奶微生物限量检验。
　　平板菌落计数法
　　这是一个最常见活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释,取一定体积稀释菌液与适宜固体培养基在凝固前均匀混合,或将菌液涂布于已凝固固体培养基平板上。保温培养后,用平板上出现菌落数乘以菌液稀释度,即可算出原菌液含菌数。通常以直径9cm平板上出现 50-500个菌落为宜, 但方法比较麻烦,操作者需有熟练技术。平板菌落计数法不仅能够得出菌液中活菌含菌数,而且同时将菌液中细菌进行了一次分离培养,取得了单克隆。
　　试剂纸法
　　在平板计数法基础上,发展了小型商品化产品以供快速计数用.形式有小型厚滤纸片,琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有适宜培养基,其中加入活性指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品含菌量。试剂纸法计数快捷正确,相比而言避免了平板计数法人为操作误差。
　　膜过滤法
　　用特殊滤膜过滤一定体积含菌样品,经丫叮橙染色,在紫外显微镜下观察细胞荧光,活细胞会发橙色荧光,而死细胞则发绿色荧光。
　　生理指标法
　　微生物生长伴伴随一系列生理指标发生改变,比如酸碱度,发酵液中含氮量,含糖量,产气量等,与生长量相平行生理指标很多,它们可作为生长测定相对值。
　　测定含氮量
　　大多数细菌含氮量为干重12.5%,酵母为7.5%,霉菌为6.0%.依据含氮量×6.25,即可测定粗蛋白含量.含氮量测定方法有很多,如用硫酸,过氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas测N2气法.Dumas测N2气法是将样品与CuO混合,在CO2气流中加热后产生氮气,搜集在呼吸计中,用KOH吸去CO2后即可测出N2量。
　　测定含碳量
　　将少许(干重0.2-2.0 mg)生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中,用2毫升2%K2Cr2O7溶液在1000C下加热30分钟后冷却.加水稀释至5毫升,在580nm波长下读取吸光光度值,即可推算出生长量.需用试剂做空白对照,用标准样品做标准曲线。
　　还原糖测定法
　　还原糖通常是指单糖或寡糖,能够被微生物直接利用,经过还原糖测定可间接反应微生物生长情况,常见于大规模工业发酵生产上微生物生长常规监测.方法是,离心发酵液,取上清液,加入斐林试剂,沸水浴煮沸3分钟,取出加少许盐酸酸化,加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液,继续加Na2S2O3至终点,查表读出还原糖含量。
　　氨基氮测定
　　方法是:离心发酵液,取上清液,加入甲基红和盐酸作指示剂,加入0.02NNaOH调色至颜色刚刚褪去,加入底物18%中性甲醛,反应数刻,加入0.02N使之变色,依据NaOH用量折算出氨基氮含量.依据培养液中氨基氮含量,可间接反应微生物生长情况。
　　其她生理物质测定
　　P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸,产气,产CO2(用标识葡萄糖做基质),耗氧,黏度,产热等指标,都可用于生长量测定.也能够依据反应前后基质浓度改变,最终产气量,微生物活性三方面测定反应微生物生长。
　　商业化微生物快速检测法
　　微生物检测,其发展方向是快速,正确,简便,自动化,目前很多生物制品企业利用传统微生物检测原理,结合不一样检测方法设计了形式各异微生物检测仪器设备,正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。
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