大肠杆菌检测方法.doc

大肠菌群及检验
一、 大肠菌群介绍

　　大肠菌群并非细菌学分类命名, 而是卫生细菌领域用语, 它不代表某一个或某一属细菌, 而指是含有一些特征一组与粪便污染相关细菌, 这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致, 其定义为: 需氧及兼性厌氧、 在37℃能分解乳糖产酸产气革兰氏阴性无芽胞杆菌。通常认为该菌群细菌可包含大肠埃希氏菌、 柠檬酸杆菌、 产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
　　大肠菌群分布较广, 在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明, 大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、 人类常常活动场所以及有粪便污染地方, 人、 畜粪便对外界环境污染是大肠菌群在自然界存在关键原因。粪便中多以经典大肠杆菌为主, 而外界环境中则以大肠菌群其她型别较多。
　　大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来, 关键是以该菌群检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数高低, 表明了粪便污染程度, 也反应了对人体健康危害性大小。粪便是人类肠道排泄物, 其中有健康人粪便, 也有肠道患者或带菌者粪便, 所以粪便内除通常正常细菌外, 同时也会有部分肠道致病菌存在（如沙门氏菌、 志贺氏菌等）, 所以食品中有粪便污染, 则能够推测该食品中存在着肠道致病菌污染可能性, 潜伏着食物中毒和流行病威胁, 必需看作对人体健康含有潜在危险性。
　　大肠菌群是评价食品卫生质量关键指标之一, 现在已被中国外广泛应用于食品卫生工作中。

二、 大肠菌群检验方法:
　　因为大肠菌群指是含有一些特征一组与粪便污染相关细菌, 即: 需氧及兼性厌氧、 在37℃能分解乳糖产酸产气革兰氏阴性无芽胞杆菌。所以大肠菌群检测通常都是根据它定义进行。
　　现在中国采取进出口食品大肠菌群检测方法关键有国家标准和原国家商检局制订行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不一样。
（一）国家标准: 国家标准采取三步法, 即: 乳糖发酵试验、 分离培养和证实试验。
　　乳糖发酵试验: 样品稀释后, 选择三个稀释度, 每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h, 观察是否产气。
　　分离培养: 将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上, 36±1℃培养18-24h, 观察菌落形态。
　　证实试验: 挑取平板上可疑菌落, 进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h, 观察产气情况。
　　汇报: 依据证实为大肠杆菌阳性管数, 查MPN表, 汇报每100ml（g）大肠菌群MPN值。
　　具体操作参见GB4789.3-94 《中国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》
（二）原国家商检局制订行业标准, 等效采取美国FDA标准方法, 用于对出口食品中大肠杆菌进行检测。本方法采取两步法:
　　推测试验: 样品稀释后, 选择三个稀释度, 每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h, 观察是否产气。
　　证实试验: 将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中, 36±1℃培养48±2h, 观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表, 汇报每ml(g)样品中大肠菌群MPN值。
　　具体操作参见 SN0169-92 《中国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》

三、 说明:
1．MPN检索表:
　　MPN 为最大可能数(Most Probable Number)简称。这种方法, 对样品进行连续系列进行稀释, 加入培养基进行培养, 从要求反应呈阳性管数出现率, 用概率论来推算样品中菌数最近似数值。
　　MPN检索表只给了三个稀释度, 如改用不一样稀释度, 则表内数字应对应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不一样, 而且结果汇报单位也不相同。
2．初发酵和证实试验:
　　不管是国家标准三步法还是行业标准两步法, 都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验, 培养基配制略有不一样, 但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群定义, 即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
　　初发酵阳性管, 不能肯定就是大肠菌群细菌, 经过证实试验后, 有时可能成为阴性。有数据表明, 食品中大肠菌群检验步骤符合率, 初发酵与证实试验相差较大。所以, 在实际检测工作中, 证实试验是必需。
3．产气量与倒管:
　　在乳糖发酵试验工作中, 常常能够看到在发酵倒管内极微少气泡（有时比小米粒还小）, 有时能够碰到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮小气泡。试验表明, 大肠菌群产气量, 多者能够使发酵倒管全部充满气体, 少者能够产生比小米粒还小气泡。假如对产酸但未产气乳糖发酵如有疑问时, 能够用手轻轻打动试管, 如有气泡沿管壁上浮, 即应考虑可能有气体产生, 而应作深入试验。
4．挑选菌落:
　　国家标准中, 需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离, 对经典和可疑菌落进行观察和证实试验。因为大肠菌群是一群细菌总称, 在平板大肠菌群菌落色泽、 形态等方面较大肠菌更为复杂和多样, 而且与大肠菌群检出率亲密相关。国家标准方法要求伊红美蓝平板为分离培养基, 在该平板上, 大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时, 检出率最高; 红色、 粉红色菌落检出率较低。
　　另外, 挑取菌落数与大肠菌群检出率有亲密关系, 只挑取一个菌落, 因为机率问题, 尤其当菌落不经典时, 极难避免假阴性出现。所以挑菌落一定要挑取经典菌落, 如无经典菌落则应多挑多个, 以免出现假阴性。
5．抑菌剂:
　　大肠菌群检验中常见抑菌剂有胆盐、 十二烷基硫酸钠、 洗衣粉、 煌绿、 龙胆紫、 孔雀绿等。抑菌剂关键作用是抑制其它杂菌, 尤其是革兰氏阳性菌生长。
　　国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂, 行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂, BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。
　　抑菌剂虽可抑制样品中部分杂菌, 而有利于大肠菌群细菌生长和挑选, 但对大肠菌群中一些菌株有时也产生部分抑制作用。有些抑菌剂用量甚微, 称量时稍有误差, 即可对抑菌作用产生影响, 所以抑菌剂添加应严格根据标准方法进行。