呋喃唑酮快速检测试剂盒说明书.doc

01版
呋喃唑酮代谢物（AOZ）快速检测试剂盒说明书

一、 原理
本试剂盒采取间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中AOZ, 在微孔条上预包被上偶联抗原, 利用抗原与抗体特异性免疫化学反应原理来进行, 样本中AOZ和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃唑酮代谢物衍生物抗体, 加入酶标识物后, 用TMB底物显色, 样品中AOZ含量与样品吸光度值呈反比, 与标准曲线比较即可得出呋喃唑酮代谢物含量。
二、 试剂盒技术指标:
试剂盒灵敏度: 0.05ppb
样本检测下限:
组织（鸡/鸭/猪/牛/羊/鱼/虾肉）—---——0.1ppb
肝脏（鸡/鸭/猪/牛/羊肝脏）--------———0.1ppb
蜂蜜、 牛奶、 肠衣--------------------------—0.1ppb
鱼/虾等水产品组织因存在一定干扰,
检测下限为0.2ppb
交叉反应率:
呋喃唑酮代谢物————————————100%
呋喃它酮代谢物———————————﹤0.1%
呋喃妥因代谢物———————————﹤0.1%
呋喃西林代谢物———————————﹤0.1%
回收率:
组织、 肝脏……………………………90%±10%
蜂蜜、 牛奶、 肠衣……………………75%±15%
三、 试剂盒组成
1、 微量测试孔: 每条8孔, 一板12条
2、 标准液X6瓶: （1ml/瓶）0ppb、 0.05ppb、 0.15ppb、 0.45ppb、 1.35ppb、 4.05ppb
3、 酶标识物 12ml………………………红色帽
4、 抗体工作液 7ml………………………蓝色帽
5、 底物A液 7 ml………………………白色帽
6、 底物B液 7 ml………………………黑色帽
7、 终止液 7 ml………………………黄色帽
8、 20X浓缩洗涤液40 ml…………………白色帽
9、 2X浓缩复溶液 50 ml…………………透明帽
10、 衍生化试剂 10ml …………………白色帽
四、 所用仪器、 试剂
含有仪器: 微孔酶标仪、 打印机、 均质器 、 氮气吹干装置、 振荡器、 离心机、 刻度移液管、 天平（感量0.01g）
微量移液器: 单道20µl-200µl, 100µl-1000µl、 多道250µl
试 剂:
氢氧化钠、 乙酸乙酯、 正己烷、 浓HCl、 磷酸氢二钾（全部样本使用）
亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5·NO·3H2O）、
ZnSO4·7H2O（奶样专用）
五、 样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时, 都必需注意:
（a）本试剂盒所检测组织样本包含: 动物组织、
禽类和水产组织。eg:鸡 鸭、 牛、 兔、 鱼、 虾等。
（b）试验中必需使用一次性吸头, 在吸收不一样试剂时要更换吸头。
（c）试验之前须检验多种试验器具是否洁净, 必需时可对试验器具进行清洁, 以避免污染干扰试验结果。
样本前处理需配制:
配液1: 用去离子水将2×浓缩复溶液按1: 1 稀释, 用于提取后样本复溶
配液2: C液: （供奶样用）称12.5g亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。
D液: （供奶样用）称29.8g 硫酸锌用去离子水溶解定溶至100ml。
配液3: 0.1MK2HPO4 称22.8g K2HPO4·3H2O
加去离子水溶解定溶至1L
配液4: 1M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。
配液5: 1M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。
样本处理方法:
(a) 奶样
1、 取出5ml奶样本到玻璃离心管中,分别加入C液和D液各250µl。
2、 用振荡器充足混合样本,用恒温离心机4000r/min以上离心10min(4-12℃).若没有恒温离心机,则先将样本降温至大约8℃,然后离心。
3、 接(b)描述方法

(b) 组织、 蜂蜜、 肠衣、 肝脏
1、 取1±0.05g均质样本(组织、 蜂蜜、 肠衣、
肝脏), 牛奶离心上清液1.1ml（相当1ml
奶样）, 分别加入4ml去离子水, 0.5ml1M
HCl和100µl衍生化试剂, 充足振荡。
2、 置于37℃过夜孵育（大约16h）或56℃水浴中孵育(2h);
3、 分别加入5ml 0.1M K2HPO4, 0.4 ml 1M
NaOH和5ml乙酸乙酯, 充足振荡5min;
4、 在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心
10min。
5、 取出2.5ml乙酸乙酯到另一洁净容器中
于50℃氮气/空气吹干。
6、 用1ml正己烷溶解干燥物, 用1ml已稀释
好复溶液充足混合30s; 在室温下（20-25℃）
4000r/min以上离心10min。
7、 取50µl下层相用于分析。
样本稀释倍数: 2
六、 酶标免疫分析程序
1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂, 置室温（20-25℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、 取出需要数量微孔及框架, 将不用微孔放入自封袋, 保留于2-8℃。
3、 配液: 将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水根据1: 19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水）, 或按所需用量配制洗涤液。
4、 编号: 将样本和标准品对应微孔按序编号, 每个样本和标准品做2孔平行, 并统计标准孔和样本孔所在位置。
5、 加标准品/样本 50µl/孔到各自微孔中, 然后加抗体50µl/孔, 用盖板膜封板, 轻轻震荡混匀。25℃环境中反应1h。
6、 取出将孔内液体甩干, 用洗液250µl/孔洗板4-5次, 每次间隔15-30秒, 用吸水纸拍干（拍干后未被清除气泡可用洁净枪头刺破）。
7、 每孔加入酶标识物100µl, 盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干, 用洗涤液充足洗, 4-5遍（同上）, 用吸水纸拍干（拍干后未被清除气泡可用洁净枪头刺破）。
8、 显色: 每孔加入底物A液50µl, 再加底物B液50µl, 轻轻振荡混匀, 25℃环境中避光显色30min。
9、 测定: 每孔加入终止液50µl, 轻轻振荡混匀, 设定酶标仪于450nm处（提议用双波长450/630nm检测, 在5min内读完数据）, 测定每孔OD值。
七、 结果判定
结果判定有两种方法, 粗略判定可用第1种方法, 定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与AOZ含量成负相关。
1、 粗略判定:
用样品平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含AOZ浓度范围（ng/ml）。假设样品1吸光度值为0.268, 样品2吸光度值为1.230, 标准液吸光度值分别是: 0ppb为1.671; 0.05ppb为1.425; 0.15ppb为1.103; 0.45ppb为0.567; 1.35ppb为0.205; 4.05ppb为0.104。则样品1浓度范围是0.45ppb-1.35ppb; 样品2浓度范围是0.05ppb-0.15ppb。乘以其对应稀释倍数即为样本中AOZ实际浓度。
2、 定量判定:
所取得每个浓度标准溶液和样本吸光度值平均值（B）除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）再乘以100%, 即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝
B
×100%
B0
B—标准溶液或样本溶液平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标, 以AOZ标准品浓度（ng/ml）半对数为横坐标, 绘制标准曲线图。将样本百分吸光率代入标准曲线中, 从标准曲线上读出样本所对应浓度, 乘以其对应稀释倍数即为样本中AOZ实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算, 更便于大量样品正确、 快速分析。
八、 注意事项
1、 用前将全部试剂温度回升至室温20-25℃。
2、 用以后立刻将全部试剂放回2-8℃冰箱。
3、 在ELISA分析中再现性, 很大程度上取决于洗板一致性, 仔细根据推荐洗板次序操作是ELISA测定程序中关键点。
4、 全部恒温孵育过程中, 避免光线照射, 用盖板膜封住微孔板。
5、 室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会造成全部标准OD值偏低。
6、 在洗板过程中假如出现板孔干燥情况, 则会伴伴随出现标准曲线不成线性, 反复性不好现象。所以洗板拍干后应立刻进行下一步操作。
7、 混合要均匀, 不然会出现反复性不好现象。
8、 反应终止液为2M硫酸, 避免接触皮肤。
9、 不要使用过了有效日期试剂盒, 稀释或搀杂使用会引发灵敏度、 OD值改变。不要交换使用不一样批号盒中试剂。
10、 不用微孔板放进自封袋密封; 标准物质和无色发色剂对光敏感, 所以要避免直接暴露在光线下。
11、 显色液若有任何颜色表明变质, 应该弃之。0标准吸光度值小于0.5时, 表示试剂可能变质。
12、 该试剂盒最好反应温度为25℃, 温度过高或过低将造成检测吸光度值和灵敏度发生改变。
九、 储藏条件和保质期
储藏条件: 试剂盒于2-8℃保留, 不要冷冻。
保 质 期: 该产品使用期为1年, 生产日期见包装盒。

提醒: 酶标板真空包装袋若有漏气, 酶标板仍然正常有效, 不影响试验结果, 请放心使用。