动物细胞培养制药工艺.pptx

1、单层贴壁培养、单层贴壁培养 概念：细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层概念：细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层细胞的培养方法。大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴细胞的培养方法。大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。生长过程：生长过程：接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面；接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面；进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。动物细胞培养动物细胞培养技术单层贴壁培养单层贴壁培养特点特点 培养容器：转瓶、玻璃珠、微载体和中空纤维等。滚瓶是培养容器：转瓶、玻璃珠、微载体和中空纤维等。滚瓶是为早期培养所采用，结构简单，投资少，重复性好。为早期培养所采用，结构简单，投资少，重复性好。优点：优点：容易更换培养液，灌注培养时，能达到高细胞密度；容易更换培养液，灌注培养时，能达到高细胞密度；有利于产物的分泌表达，可改变培养液与细胞的比例。有利于产物的分泌表达，可改变培养液与细胞的比例。缺点：缺点：操作较繁杂劳动强度大操作较繁杂劳动强度大检测受到限制检测受到限制培养条件难以均一培养条件难以均一传质和传氧差传质和传氧差占用空间大，产量低，放大培养是瓶颈。占用空间大，产量低，放大培养是瓶颈。动物细胞培养动物细胞培养技术2、悬浮培养、悬浮培养 概念：细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培概念：细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培 养过程。养过程。优点：优点：操作简单，培养条件相对均一操作简单，培养条件相对均一传质和传氧较好，容易放大培养。传质和传氧较好，容易放大培养。缺点：缺点：细胞体积小细胞体积小密度低密度低培养病毒易失去标记而降低免疫能力。培养病毒易失去标记而降低免疫能力。适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤。适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤。借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。培养容器：通气式搅拌和气升式生物反应器培养容器：通气式搅拌和气升式生物反应器动物细胞培养动物细胞培养技术3、微囊培养、微囊培养 微囊培养：在无菌条件下将拟微囊培养：在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质培养的细胞、生物活性物质及生长介质及生长介质共同包裹在薄的共同包裹在薄的半透膜中半透膜中形成微囊形成微囊,再将微囊放再将微囊放入入培养系统内进行悬浮培养培养系统内进行悬浮培养。适用于贴壁和非贴壁培养。适用于贴壁和非贴壁培养。动物细胞培养动物细胞培养技术1.4%海藻酸钠溶液 多聚赖氨酸 搅拌式或气升式反应器系统 3、微囊培养、微囊培养 微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内。微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内。培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗体，纯化工培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗体，纯化工艺简单，应用前景广。艺简单，应用前景广。多聚赖氨酸多聚赖氨酸/海藻酸固定细胞：凝胶载体的表面被多聚海藻酸固定细胞：凝胶载体的表面被多聚赖氨酸覆盖，形成一层多孔可透薄膜，再使凝胶载体液赖氨酸覆盖，形成一层多孔可透薄膜，再使凝胶载体液化，便可制成微囊产品的纯度高。化，便可制成微囊产品的纯度高。杂交瘤细胞与海藻酸钠溶液混合，经微囊发生器，微杂交瘤细胞与海藻酸钠溶液混合，经微囊发生器，微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后用聚氨基酸处理，球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后用聚氨基酸处理，使微球表面成膜，再用柠檬酸去钙离子，球内海藻酸钠使微球表面成膜，再用柠檬酸去钙离子，球内海藻酸钠成液态，细胞在在微囊内悬浮。成液态，细胞在在微囊内悬浮。动物细胞培养动物细胞培养技术3、微囊培养、微囊培养 微囊法优点：微囊法优点：可防止细胞在培养过程中受到物理损伤可防止细胞在培养过程中受到物理损伤能从囊中自由出入半透膜，从而提高细胞密度和产物能从囊中自由出入半透膜，从而提高细胞密度和产物含量，并方便分离纯化处理。含量，并方便分离纯化处理。缺点缺点:微囊制作复杂微囊制作复杂,成功率不高成功率不高 微囊内死亡的细胞会污染正常产物微囊内死亡的细胞会污染正常产物 收集产物必须破壁收集产物必须破壁,不能实现生产连续化不能实现生产连续化 动物细胞培养动物细胞培养技术4、微载体培养、微载体培养 微载体：是指直径在微载体：是指直径在60-250m，能适用于贴壁细胞生长，能适用于贴壁细胞生长的微珠。的微珠。特点：特点：微载体的大小：增大单位体积内表面积，对细胞的生长非常有利。微载体的大小：增大单位体积内表面积，对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200m之间。之间。微载体的密度：一般为微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。密度可逐渐增大。微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生度过大，反而会产生“毒性毒性”效应。效应。微载体微载体 动物细胞培养动物细胞培养技术微载体培养微载体培养 概念：细胞贴附于微载体上伸展和增殖，再悬浮于培概念：细胞贴附于微载体上伸展和增殖，再悬浮于培养液中的培养过程。养液中的培养过程。优点：优点：细胞生长的环境均一细胞生长的环境均一培养基利用率高培养基利用率高重复性好重复性好减少了劳动强度，容易放大。减少了劳动强度，容易放大。兼具贴壁和悬浮培养的双重优点兼具贴壁和悬浮培养的双重优点 种类：微载体，多孔微载体。种类：微载体，多孔微载体。应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原。应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原。动物细胞培养动物细胞培养技术原理：是将对细胞无害的颗粒原理：是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，和扩展成单层三个阶段。细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。率和相融性。原原 理理 动物细胞培养动物细胞培养技术微载体培养操作要点微载体培养操作要点 培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的pH与温度水平，与温度水平，接种细胞至终体积接种细胞至终体积1/3的培养液中。的培养液中。贴壁阶段（贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。加搅拌速度保证完全均质混合。培养维持期：进行细胞计数、葡萄糖测定及细胞形态镜检。培养维持期：进行细胞计数、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过3d左右，培养液开始呈左右，培养液开始呈酸性酸性，需换液：停止搅拌，让微珠沉，需换液：停止搅拌，让微珠沉淀淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37），重新开始搅拌。），重新开始搅拌。收获细胞：收获细胞：微载体培养的放大：微载体培养的放大：动物细胞培养动物细胞培养技术微载体培养操作要点微载体培养操作要点 培养初期培养初期 贴壁阶段贴壁阶段 培养维持期：培养维持期：收获细胞：排干培养液，至少用缓冲液漂洗收获细胞：排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。然后解离收。然后解离收集细胞及其产品。集细胞及其产品。微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行积进行 动物细胞培养动物细胞培养技术1、分批式操作、分批式操作 已用于搅拌式反应器或气升式反应器培养杂交瘤细胞，生已用于搅拌式反应器或气升式反应器培养杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。产单克隆抗体。分批培养杂交瘤和骨髓瘤细胞的周期为分批培养杂交瘤和骨髓瘤细胞的周期为35天，细胞密度天，细胞密度达达25105/ml。单克隆抗体的产量约。单克隆抗体的产量约10100 mg/L。在大规模搅拌反应器中，细胞密度较低，最终达在大规模搅拌反应器中，细胞密度较低，最终达5106，而，而在在7501500 cm2的转瓶生产中，细胞密度达的转瓶生产中，细胞密度达12108。17.4.17.4.4 4动物细胞培养操作方式动物细胞培养操作方式动物细胞培养动物细胞培养技术2、流加式操作、流加式操作 最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。通过流加控制，可实现高密度培养。通过流加控制，可实现高密度培养。杂交瘤细胞培养，细胞密度可达杂交瘤细胞培养，细胞密度可达1.4107，生产抗体的产量，生产抗体的产量比分批操作提高几比分批操作提高几10倍，可达倍，可达500 mg/L。由于培养体积不断变化，流加对过程的控制能力仍然有限由于培养体积不断变化，流加对过程的控制能力仍然有限在实际生产中应用少。在实际生产中应用少。动物细胞培养动物细胞培养技术3、半连续式操作、半连续式操作 动物细胞培养生产药物中经常采用。已应用于大规模生产动物细胞培养生产药物中经常采用。已应用于大规模生产乙肝表面抗原、乙肝表面抗原、t-PA等基因工程产物。等基因工程产物。半连续操作特别适用于分泌表达型细胞，如杂交瘤细胞的半连续操作特别适用于分泌表达型细胞，如杂交瘤细胞的培养，尤其是微载体系统。培养，尤其是微载体系统。微载体系统培养基因工程微载体系统培养基因工程CHO细胞，待细胞长满载体后，细胞，待细胞长满载体后，反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原，制备乙肝疫苗。反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原，制备乙肝疫苗。该方式操作简单，使细胞密度和产量维持在较高水平，能该方式操作简单，使细胞密度和产量维持在较高水平，能在较长时间内进行持续生产，反复收获产物，生产效率高，在较长时间内进行持续生产，反复收获产物，生产效率高，是动物细胞培养生产药物中经常被采用的方式。是动物细胞培养生产药物中经常被采用的方式。动物细胞培养动物细胞培养技术4、罐流操作、罐流操作 概念：是一种细胞被截留在反应器内的连续操作方式。在概念：是一种细胞被截留在反应器内的连续操作方式。在培养后期不断的加入新鲜培养基，同时以同样的流量排出部培养后期不断的加入新鲜培养基，同时以同样的流量排出部分培养基，借助于出口介质过滤把细胞滞留在反应器内的培分培养基，借助于出口介质过滤把细胞滞留在反应器内的培养方式。是最受推崇的用动物细胞生产药物的方式。养方式。是最受推崇的用动物细胞生产药物的方式。罐流体系的分类罐流体系的分类 全部截留全部截留:100截留细胞，如固定化包埋细胞，可通过中截留细胞，如固定化包埋细胞，可通过中空纤维、平板膜、凝胶颗粒和微囊等实现；空纤维、平板膜、凝胶颗粒和微囊等实现；部分截留部分截留:使用微载体系统、贴壁系统、分离悬浮系统等使用微载体系统、贴壁系统、分离悬浮系统等实现。实现。流流化化床床包包埋埋培培养养人人鼠鼠杂杂交交瘤瘤细细胞胞，整整个个反反应应器器有有效效浓浓度度达达4108/ml，单位体积产量提高，单位体积产量提高200300倍。倍。动物细胞培养动物细胞培养技术4、罐流操作、罐流操作 优点：优点：全部截留全部截留 大大提高了细胞生长密度和产物浓度。大大提高了细胞生长密度和产物浓度。利用培养基，降低细胞代谢废物，细胞生长良好。利用培养基，降低细胞代谢废物，细胞生长良好。产物为分泌蛋白质，滞留时间短，避免了产物的聚合、产物为分泌蛋白质，滞留时间短，避免了产物的聚合、降解等产量和活性形式的变化，有利于纯化。降解等产量和活性形式的变化，有利于纯化。中空纤维生物反应器、固定床或流化床反应器、膜生物中空纤维生物反应器、固定床或流化床反应器、膜生物反应器等的唯一可操作方式。反应器等的唯一可操作方式。缺点：要求复杂仪器设备控制灌流操作过程，由于过滤器缺点：要求复杂仪器设备控制灌流操作过程，由于过滤器容易堵塞，从而限制培养次数。容易堵塞，从而限制培养次数。动物细胞培养动物细胞培养技术2、罐流操作优缺点、罐流操作优缺点 提高细胞培养密度，和产物浓度。提高细胞培养密度，和产物浓度。可控制培养液处于低废物的水平，细胞生长好，延长可控制培养液处于低废物的水平，细胞生长好，延长培养周期。培养周期。产物为分泌蛋白质，滞留时间短，避免了产物的聚合、产物为分泌蛋白质，滞留时间短，避免了产物的聚合、降解等产量和活性形式的变化，有利于纯化。降解等产量和活性形式的变化，有利于纯化。缺点：要求复杂仪器设备控制灌流操作过程，由于过缺点：要求复杂仪器设备控制灌流操作过程，由于过滤器容易堵塞，从而限制培养次数。滤器容易堵塞，从而限制培养次数。动物细胞培养动物细胞培养技术第十七章第十七章 动物细胞培养动物细胞培养 制药工艺制药工艺第一节第一节 制药动物细胞的表达与特征制药动物细胞的表达与特征第二节第二节 基因工程动物细胞系的构建基因工程动物细胞系的构建第三节第三节 动物细胞培养基制备动物细胞培养基制备第四节第四节 动物细胞培养技术动物细胞培养技术第五节第五节 培养过程检测与工艺控制培养过程检测与工艺控制 生长环境参数：温度、生长环境参数：温度、pH、溶氧、转速、液流量、溶氧、转速、液流量 培养基成分变化参数：葡萄糖消耗率、乳酸生成率、铵离子浓度培养基成分变化参数：葡萄糖消耗率、乳酸生成率、铵离子浓度 生长状态参数：形态变化、活性高低、密度大小生长状态参数：形态变化、活性高低、密度大小 目标产物生产率：产物合成与积累速度，分泌目标产物生产率：产物合成与积累速度，分泌 微生物的污染参数微生物的污染参数动物细胞培养过程检测与工艺17.5.117.5.1细胞活性与形态检测细胞活性与形态检测 17.5.17.5.2 2微生物污染的检测与防止微生物污染的检测与防止17.5.17.5.3 3培养基成分的检测与代谢控制培养基成分的检测与代谢控制第五节第五节 培养过程检测与工艺控制培养过程检测与工艺控制17.5.17.5.4搅拌剪切的检测与控制搅拌剪切的检测与控制动物细胞培养过程检测与工艺1、细胞数目与活性的检测细胞数目与活性的检测动物细胞培养过程检测与工艺17.5.117.5.1细胞活性与形态检测细胞活性与形态检测 离线分析：血细胞计数板或分光光度计，确定反应器离线分析：血细胞计数板或分光光度计，确定反应器中的细胞数目。中的细胞数目。在线分析：近红外线传感器，可把细胞计数和活性控在线分析：近红外线传感器，可把细胞计数和活性控制结合在一起制结合在一起 细胞活性细胞活性：组织化学染色法和细胞形态的观察检测细：组织化学染色法和细胞形态的观察检测细胞活性。台盼篮染色排除法，胞活性。台盼篮染色排除法，MTT比色分析比色分析2、细胞凋亡、细胞凋亡 概念：细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，概念：细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程。凋亡细胞排斥活体染料，台盼篮不能检测。凋亡细胞排斥活体染料，台盼篮不能检测。光学显微镜：直接形态观察凋亡小体光学显微镜：直接形态观察凋亡小体 荧光显微镜：荧光染料染色，观察细胞核的形态荧光显微镜：荧光染料染色，观察细胞核的形态动物细胞培养过程检测与工艺细胞死亡有两种形式，即凋亡和坏死，其形态学细胞死亡有两种形式，即凋亡和坏死，其形态学和生化变化完全不同。和生化变化完全不同。坏坏死死：细细胞胞受受到到严严重重伤伤害害时时快快速速膨膨胀胀，染染色色质质凝凝聚聚，而而死死亡，细胞直接裂解，亡，细胞直接裂解，坏死过程不受细胞自主控制。坏死过程不受细胞自主控制。细菌污染：肉汤培养基于细菌污染：肉汤培养基于37恒温培养，检查。恒温培养，检查。支原体污染：染色、培养和共培养，至少同时使用两支原体污染：染色、培养和共培养，至少同时使用两种方法。使用抗生素、卡那霉素、金霉素处理培养物。种方法。使用抗生素、卡那霉素、金霉素处理培养物。特异性的支原体血清、高温、支原体去除剂。特异性的支原体血清、高温、支原体去除剂。高温处理，支原体和细胞的耐热性不同，支原体敏感。高温处理，支原体和细胞的耐热性不同，支原体敏感。17.5.17.5.2 2微生物污染的检测与防止微生物污染的检测与防止动物细胞培养过程检测与工艺 营养的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的减少为指标营养的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的减少为指标 副产物的积累：乳酸和铵离子的增加副产物的积累：乳酸和铵离子的增加 近红外测量技术可实现葡萄糖的在线检测近红外测量技术可实现葡萄糖的在线检测 控制铵离子浓度低于控制铵离子浓度低于2-4mmol/L。乳酸低于。乳酸低于60mmol/L17.5.17.5.3 3培养基成分的检测与代谢控制培养基成分的检测与代谢控制1、基质消耗的检测、基质消耗的检测 动物细胞培养过程检测与工艺 葡萄糖限量：减少乳酸量，增加葡萄糖的产量系数。葡萄糖限量：减少乳酸量，增加葡萄糖的产量系数。谷氨酸限量：减少铵盐和氨基酸的生成。谷氨酸限量：减少铵盐和氨基酸的生成。进行双控制（同时控制葡萄糖和进行双控制（同时控制葡萄糖和Gln），乳酸和铵离），乳酸和铵离将同时减少，使细胞代谢变得有效。将同时减少，使细胞代谢变得有效。生产工艺中，生产工艺中，优化二者之间的关系优化二者之间的关系，使之协调。，使之协调。2、代谢控制、代谢控制 动物细胞培养过程检测与工艺 搅拌混合：生物反应器提供了均相环境，提高氧及其搅拌混合：生物反应器提供了均相环境，提高氧及其它营养物质的传递速率，剪切力会对细胞造成损伤。它营养物质的传递速率，剪切力会对细胞造成损伤。对细胞损伤可用细胞外蛋白浓度来表示，它决定了细对细胞损伤可用细胞外蛋白浓度来表示，它决定了细胞的裂解程度。细胞内胞的裂解程度。细胞内LDH维持一个常数。维持一个常数。通过监测通过监测LDH释放可评价不同搅拌对细胞的损伤程释放可评价不同搅拌对细胞的损伤程 度。度。1、搅拌剪切的检测、搅拌剪切的检测 17.5.17.5.4搅拌剪切的检测与控制搅拌剪切的检测与控制动物细胞培养过程检测与工艺1、搅拌剪切的检测、搅拌剪切的检测 17.5.17.5.4搅拌剪切的检测与控制搅拌剪切的检测与控制动物细胞培养过程检测与工艺搅拌速度与细胞损伤之间的关系是与反应器的结构相关联的，如搅搅拌速度与细胞损伤之间的关系是与反应器的结构相关联的，如搅拌速度、叶轮顶部速度、综合剪切因素及拌速度、叶轮顶部速度、综合剪切因素及Kolmogorov漩涡尺寸等，漩涡尺寸等，这些参数还不能用于生物反应器的放大。这些参数还不能用于生物反应器的放大。不同类型细胞对流体力的应答不同，应注意细胞系的特性。不同生不同类型细胞对流体力的应答不同，应注意细胞系的特性。不同生物反应器产生不同的细胞应力，细胞能承受的机械应力取决于搅拌物反应器产生不同的细胞应力，细胞能承受的机械应力取决于搅拌桨的形状及其直径和转速、罐体及其直径以及液相比例。桨的形状及其直径和转速、罐体及其直径以及液相比例。根据搅拌转速对细胞细胞损伤的影响，可确定培养基保护添加剂和根据搅拌转速对细胞细胞损伤的影响，可确定培养基保护添加剂和搅拌桨的伤害作用等。搅拌桨的伤害作用等。表面通气反应器：避免漩涡。高速搅拌，安装挡板表面通气反应器：避免漩涡。高速搅拌，安装挡板 填充反应器：无顶部气体空间，消除夹带和气泡破裂填充反应器：无顶部气体空间，消除夹带和气泡破裂 鼓泡反应器：气体从反应器中移走，或使用高径比较鼓泡反应器：气体从反应器中移走，或使用高径比较大的反应器进行悬浮培养大的反应器进行悬浮培养 搅拌和鼓泡反应器：使用剪切保护剂搅拌和鼓泡反应器：使用剪切保护剂 多微孔载体：用各种搅拌检测，显微镜下检查微载体多微孔载体：用各种搅拌检测，显微镜下检查微载体的机械损伤程度的机械损伤程度搅拌反应器的设计搅拌反应器的设计 动物细胞培养过程检测与工艺动物细胞培养动物细胞培养技术思考题1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？是什么成份？没有没有是是成块的组织细胞靠在一起成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖彼此限制了细胞的生长和增殖先用剪刀剪碎先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理后用蛋白酶处理胰蛋白酶水解蛋白质胰蛋白酶水解蛋白质 细胞间的成份是蛋白质细胞间的成份是蛋白质思考题、细胞膜的主要成份是什么？、细胞膜的主要成份是什么？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？成单个细胞要注意什么问题呢？、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？龄动物的组织或器官，请解释原因？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂能能注意时间的控制注意时间的控制不能，因为两的最适不能，因为两的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适境与胰蛋白酶的最适PH较接近较接近胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛思考题11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养这样的过程叫做传代培养思考题11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养这样的过程叫做传代培养动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬浮悬浮液液原代培原代培养养细胞增殖细胞增殖部分细胞部分细胞无限传代无限传代去掉组织去掉组织间蛋白间蛋白动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成生物体最终培养成生物体传代培传代培养养