总结总直接胆红素的检测方法.doc

血清总胆红素和直接（结合）胆红素测定
现在测定血清胆红素方法关键有重氮试剂法（包含改良J-G法、 二甲亚砜法、 二氯苯重氮盐法和2, 5二氯苯重氮四氟硼酸盐法等）、 胆红素氧化酶法、 钒酸盐氧化法、 高效液相色谱法、 导数分光光度法、 经皮胆红素测定法以及直接分光光度法等。
改良咖啡因（J-G）法:
一、 试验原理
血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应, 生成紫色偶氮胆红素; 在一样条件下, 未结合胆红素须有加速剂破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应。咖啡因、 苯甲酸钠作为加速剂, 醋酸钠缓冲液可维持反应PH值同时兼有加速作用。叠氮钠破坏剩下重氮试剂, 终止结合胆红素测定管偶氮反应。最终加入碱性酒石酸钠, 在碱性条件下, 紫色偶氮胆红素转变为蓝色偶氮胆红素, 使最大吸光度由530nm转移到598nm, 此时, 非胆红素黄色色素及其它红色与棕色色素产生吸光度可忽略不计, 使测定灵敏度和特异性增加。最终形成绿色是由蓝色碱性偶氮胆红素和咖啡因与对氨基苯磺酸之间形成黄色色素混合而成。
二、 试验方法
（一）器材
试管, 刻度吸管, 分光光度计, 37℃水浴箱。
（二）试剂
1．咖啡因-苯甲酸钠试剂 无水醋酸钠41g, 苯甲酸钠37.5g, 乙二胺四乙酸二钠EDTANa2 0.5g, 溶于约500mL 蒸馏水中, 再加入咖啡因25g, 搅拌至完全溶解(不可加热), 然后加蒸馏水稀释至1000mL, 混匀, 过滤后放置棕色试剂瓶中, 室温保留可稳定6个月。
2. 5g/L 亚硝酸钠溶液: 亚硝酸钠5.0g, 加蒸馏水溶解并稀释至100mL, 若发觉溶液呈淡黄色时, 应丢弃重配。
3. 5g/L 对氨基苯磺酸溶液: 对氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H20）5.0g, 加于约800mL 蒸馏水中, 加浓盐酸15mL, 待完全溶解后, 加蒸馏水至1000mL。
4. 重氮试剂 临用前, 取5g/L 亚硝酸钠溶液（试剂2）0.5mL 与5g/L 对氨基苯磺酸溶液（试剂3）20mL 混合。
5. 5g/L 叠氮钠溶液: 叠氮钠0.5g, 用蒸馏水溶解并稀释至100mL。
6. 碱性酒石酸钠溶液: 氢氧化钠75g, 酒石酸钠(Na2C4H4O6·2H2O)263g, 加蒸馏水溶解并稀释至1000mL, 混匀, 置塑料瓶中, 室温保留可稳定6个月。
7.胆红素标准液 可购置, 也可按以下方法配制:
（1）稀释血清: 搜集不溶血、 无黄疽、 清楚血清过滤作为混合血清稀释剂。取过滤血清1.0ml, 加生理盐水24ml, 混匀。在分光光度计中, 以比色杯光径1cm, 波长414nm, 用生理盐水调零, 读取吸光度应小于0.100, 波长460nm 处读取吸光度应小于0.040。
（2）171umol/L胆红素标准液: 称取符合标准胆红素（MW:584.68）10mg, 加入二甲基亚砜1ml, 玻棒搅匀, 加入0.05mol/LNa2CO3溶液2ml, 使胆红素完全溶解。移入100ml容量瓶, 用稀释血清洗涤数次并移入容量瓶中, 缓慢加入0.1mol/LHCl溶液2ml（边加边缓慢摇动, 切勿产生气泡）, 最终用稀释血清稀释至100ml。避光, 4℃保留, 三天内有效, 最好当日绘制标准曲线。
（三）步骤
1. 取试管3支, 标明总胆红素管、 结合胆红素管和空白管, 然后按下表操作:

试剂(ml) 总胆红素管 结合胆红素管 空白管
血清 0.2 0.2 0.2
咖啡因-苯甲酸钠试剂 1.6 - 1.6
氨基苯磺酸溶液 - - 0.4
重氮试剂 0.4 0.4 -
混匀, 总胆红素管置室温10min, 结合胆红素管置37℃水浴正确放置1min, 按下表继续操作:
叠氮钠溶液 - 0.05 -
咖啡因-苯甲酸钠试剂 - 1.55 -
碱性酒石酸钠溶液 1.2 1.2 1.2
充足混匀后, 用空白管调零, 于波长600nm, 读取总胆红素管和结合胆红素管吸光度, 在标准曲线上查出对应胆红素浓度。
胆红素氧化酶法
一、 试验原理
胆红素呈黄色, 在450nm周围有最大吸收峰。胆红素氧化酶(BOD)催化胆红素氧化, 伴随胆红素被氧化, A450nm下降, 下降程度与胆红素被氧化量相关。在pH8.0条件下, 未结合胆红素及结合胆红素均被氧化, 所以检测450nm吸光度下降值可反应总胆红素含量; 加入SDS及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。
在pH3.7～4.5缓冲液中, BOD催化单葡萄糖醛酸胆红素(mBc)、 双葡萄糖醛酸胆红素(dBc)及大部分δ胆红素氧化, 非结合胆红素(Bu)在此pH条件下不被氧化。用配制于人血清中二牛磺酸胆红素(ditaurobilirubin, DTB)作标准品, 检测此条件下450nm吸光度下降值可反应结合胆红素含量。
二、 试验方法
1．0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.2) 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.211g, 胆酸钠172.3mg,十二烷基硫酸钠(SDS)432.6mg, 溶于去离子水90ml中, 在室温(25～30℃)用1mol/L盐酸调整pH至8.2(约用6ml), 再加蒸馏水至100ml, 置冰箱保留, 此液含4mmol/L胆酸钠、 15mmol/L SDS。
2．0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)。
3．BOD溶液 如系冻干品, 按说明书要求复溶, 但复溶后冰箱保留不宜过长(约可保留1周), 如系液体(可能含有甘油), 置4℃冰箱可保留较长时间, BOD贮存溶液酶活性通常在数千至1万～2万U/L, BOD工作液酶活性可按反应液中BOD终浓度达0.3～1.0U/ml计算。
4．总胆红素标准液(342μmol/L) 按胆红素测定J-G法中方法配制, 或市售合乎要求标准液。
5．结合胆红素标准液 将DTB配于胆红素浓度可忽略不计人血清中, 或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内, －70℃保留, 可稳定6个月。冻干品未重建前置低温中, 最少稳定1年。

加入BOD工作液后立刻混匀, 置37C水浴5min, 用分光光度计, 在450nm波长, 去离子水调零, 读取各管吸光度(A)。用于对照管比色杯与非对照管比色杯不得混用。
钒酸盐氧化法(试剂盒)
一、 原理
在PH=3左右, 有表面活性剂和间接反应胆红素抑制剂条件下, 样品中直接胆红素被氧化剂钒酸钠氧化为胆绿素。胆红素黄色特异性吸光度下降, 经过测定钒酸盐氧化前后吸光度改变, 计算样品中直接胆红素含量。
二、 试验方法
试剂: 柠檬酸缓冲液100mM
表面活性剂2mmol/L
磷酸缓冲液10mM
偏钒酸钠4mmol/L
适适用于半/全自动生化分析仪, 两周内用完。
样本/标准/水
sample volume
μ1
14
试剂1（R1）
Reagent 1
μl
280
样本+R1 在37℃保温60秒, 统计吸光度值A1
试剂2（R2）
Reagent 2
μl
70
在加入R2 保温300 秒后, 统计吸光度值A2。
主波长
main wavelength
nm
450
副波长
sub wavelength
nm
546
反应类型
reaction type

两点终点法
反应方向
reaction direction

降反应(-)