NMR蛋白质结构解析.pptx

第五章第五章 蛋白质结构解析蛋白质结构解析第二节第二节 核磁共振波谱的溶液结构解析核磁共振波谱的溶液结构解析一、核磁概述一、核磁概述瑞士科学家发明了瑞士科学家发明了“利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构法维结构法”。这种方法的优点是可对溶液中的蛋白质进行分析。原理可以用测这种方法的优点是可对溶液中的蛋白质进行分析。原理可以用测绘房屋的结构来比喻，首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对绘房屋的结构来比喻，首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象象,然后测量所有相邻拐角间的距离和方位然后测量所有相邻拐角间的距离和方位,据此就可以推知房屋据此就可以推知房屋的结构。的结构。维特里希选择生物大分子中的质子维特里希选择生物大分子中的质子(氢原子核氢原子核)作为测量对象作为测量对象,连连续测定所有相邻的续测定所有相邻的2 2个质子之间的距离和方位个质子之间的距离和方位,这些数据经计算机这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。处理后就可形成生物大分子的三维结构图。1、NMR基本原理核磁共振是一种吸收光谱，核磁共振是一种吸收光谱，在外磁场的作用下，核自旋能级发生分裂，当在外磁场的作用下，核自旋能级发生分裂，当用无线电波范围的电磁辐射照射样品时，不同用无线电波范围的电磁辐射照射样品时，不同结构中的原子核吸收适当频率电磁辐射，发生结构中的原子核吸收适当频率电磁辐射，发生核能跃迁，产生共振信号，记录信号的位置和核能跃迁，产生共振信号，记录信号的位置和强度就得到强度就得到NMR波谱。波谱。NMR的基本原理的基本原理原子核的自旋运动原子核的自旋运动 原子核具有一定的质量和一定的体积，原子核具有一定的质量和一定的体积，可以把它看成是一个接近球形的固体。实验表明，大多数可以把它看成是一个接近球形的固体。实验表明，大多数的原子核如同陀螺一样，都围绕着某个轴作自旋运动。例的原子核如同陀螺一样，都围绕着某个轴作自旋运动。例如，常见的如，常见的 H1和和C13核等都具有这种运动。核等都具有这种运动。无自旋运动的无自旋运动的 有自旋运动的核有自旋运动的核 陀螺的自旋运动陀螺的自旋运动2、核磁共振中几个常用的参数、核磁共振中几个常用的参数化学位移：化学位移：把由于原子和分子中核的化学环境不等价而引把由于原子和分子中核的化学环境不等价而引起拉摩尔进动频率的变化叫做化学位移。起拉摩尔进动频率的变化叫做化学位移。自旋自旋偶合：自旋自旋偶合：由于分子内部原子核的磁相互作用引起的由于分子内部原子核的磁相互作用引起的通过电子壳层传递的，使分子中的核在电子壳层中感应出通过电子壳层传递的，使分子中的核在电子壳层中感应出一个磁矩，然后再作用到被侧核上，从而改变了被侧核的一个磁矩，然后再作用到被侧核上，从而改变了被侧核的共振条件，使谱线分裂为多重线。这种谱线的精细结构也共振条件，使谱线分裂为多重线。这种谱线的精细结构也称为自旋称为自旋自旋分裂。自旋分裂。驰豫时间：驰豫时间：核自旋系统由于受到外界作用离开平衡状态后，核自旋系统由于受到外界作用离开平衡状态后，能够自动地向平衡状态恢复，即从高能级恢复到基态的过能够自动地向平衡状态恢复，即从高能级恢复到基态的过程称为弛豫过程。弛豫现象是由于物质相互作用而发生的，程称为弛豫过程。弛豫现象是由于物质相互作用而发生的，弛豫时间是描述这种相互作用的参数。弛豫时间是描述这种相互作用的参数。核磁共振波谱仪原理核磁共振波谱仪原理 两两个个磁磁铁铁产产生生均均匀匀、稳稳定定的的静静磁磁场场HoHo，两两磁磁极极间间放放样样品品管管，并并有有一一机机械械旋旋转转装装置置，可可使使样样品品管管在在两两极极间间旋旋转转。样样品品管管外外面面是是射射频频振振荡荡线线圈圈，它它被被安安装装在在与与外外磁磁场场HoHo垂垂直直的的方方向向，可可发发射射固固定定频频率率的的无无线线电电波波。该该磁磁场场的的有有效效部部分分是是一一个个强强度度为为H H1 1绕绕着着H H0 0旋旋转转的的磁磁场场，当当射射频频频频率率等等于于核核的的进进动动频频率率（=H=H0 0）时时，发发生生共共振振。把把得得到到的的信信号号送送到到射射频频接接收收器器，经经射射频频放放大大器器放放大大，通通过过相相位位调调节节，得得到到所所需需要要的的纯纯吸吸收收型型或或色色散型信号，并由记录器给出谱图。散型信号，并由记录器给出谱图。射频发生器射频发生器射频接收器射频接收器电电磁磁铁铁N电电磁磁铁铁S线圈线圈记录仪记录仪扫描发生器扫描发生器生物生物NMR常用实验技术常用实验技术同核相关谱同核相关谱（COSY）用来鉴定具有偶合关系的质子对。其形态为矩形图）用来鉴定具有偶合关系的质子对。其形态为矩形图谱中间分布着一些同心圆，实际上是一些吸收峰的等高线截面图，称为交谱中间分布着一些同心圆，实际上是一些吸收峰的等高线截面图，称为交叉或相关峰，表示相应质子间存在着偶合关系。叉或相关峰，表示相应质子间存在着偶合关系。双量子滤波相关谱双量子滤波相关谱（DQF-COSY）一般采用所谓时间相位比例增量法）一般采用所谓时间相位比例增量法(TPPI)记录谱图，即所谓的相敏记录谱图，即所谓的相敏COSY谱。其每一个交叉峰都由若干个正谱。其每一个交叉峰都由若干个正负相间的信号组成，其所构成的精细结构包含有质子间复杂的偶合关系和负相间的信号组成，其所构成的精细结构包含有质子间复杂的偶合关系和偶合常数等进一步的信息。偶合常数等进一步的信息。全相关谱全相关谱(TOCSY)又称又称 HOHAHA谱，在它的脉冲序列中包含有自旋锁谱，在它的脉冲序列中包含有自旋锁定的步骤，能将一个自旋体系的全部自旋相关联。定的步骤，能将一个自旋体系的全部自旋相关联。NOE相关谱相关谱（NOESY）用于鉴定质子在空间的相互接近。空间相互接近）用于鉴定质子在空间的相互接近。空间相互接近的质子之间，会产生交叉驰豫的现象，即的质子之间，会产生交叉驰豫的现象，即NOE效应。效应。ROESY谱谱 是在一种旋转坐标下测定的是在一种旋转坐标下测定的NOESY谱谱 。NMR测定蛋白质三维结构的基本过程测定蛋白质三维结构的基本过程 蛋蛋白白质质三三维维结结构构N NM MR R波波谱谱分分析析适用范围适用范围分子量分子量分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫时间减少（线宽增加）时间减少（线宽增加）同核二维同核二维1H谱：谱：80氨基酸氨基酸异核多维二维、三维）：异核多维（二维、三维）：常规三共振（常规三共振（1H,15N,13C）200氨基酸氨基酸氘标记，特殊标记氘标记，特殊标记 已报道有已报道有700氨基酸氨基酸同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物学方法培养制备学方法培养制备标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备常规样品常规样品浓度：毫摩尔每升浓度：毫摩尔每升 500uL 10kDa 5毫克每样品毫克每样品均一均一没有聚合没有聚合水溶液（水溶液（10%重水锁场）重水锁场）pH7.5常用缓冲体系：常用缓冲体系：Tris-HCl,磷酸盐，醋酸盐磷酸盐，醋酸盐稳定性：室温下大于一周稳定性：室温下大于一周NaN3蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂NMR研究蛋白质结构实验步骤研究蛋白质结构实验步骤 u研究样品的选择与制备：研究样品的选择与制备：1.样品选择：分子量、样品量、溶解度、样品纯度、稳定性样品选择：分子量、样品量、溶解度、样品纯度、稳定性 2.核磁样品管：选择、清洗、干燥、样品体积等。核磁样品管：选择、清洗、干燥、样品体积等。3.样品制作：浓缩方法样品制作：浓缩方法、脱盐和缓冲剂交换、脱盐和缓冲剂交换、水、水-重水的交重水的交 换换、过、过滤方法滤方法、样品的脱气、样品的脱气 等。等。4.样品参数：样品参数：pH值、离子强度、缓冲液种类、溶剂浓度、表面活性值、离子强度、缓冲液种类、溶剂浓度、表面活性剂的增溶作用、样品温度、化学位移参考物。剂的增溶作用、样品温度、化学位移参考物。5.防止样品污染：顺磁性物质（金属）、微生物污染防止样品污染：顺磁性物质（金属）、微生物污染uNMR数据的采集与数据处理：中心频率、谱宽、数据点、接收器增益数据的采集与数据处理：中心频率、谱宽、数据点、接收器增益设定和水峰抑制。设定和水峰抑制。u质子自旋系统的识别与信号归属；质子自旋系统的识别与信号归属；u决定结构约束因子和分析规则二级结构；决定结构约束因子和分析规则二级结构；u计算出符合约束因子的三维结构和进行结构精修；计算出符合约束因子的三维结构和进行结构精修；NMR在生物应用中的优越性在生物应用中的优越性u被测的生物样品不被破坏；被测的生物样品不被破坏；u能测定与生物状态接近的溶液中能测定与生物状态接近的溶液中 生物高分子的结构与浓度；生物高分子的结构与浓度；u 研究生物样品的动力学过程及其研究生物样品的动力学过程及其 相应的能量变化规律；相应的能量变化规律；u能获得多种参数，为分析生物分能获得多种参数，为分析生物分 子结构提供多种信息；子结构提供多种信息；u能研究生物高分子构像的动力学；能研究生物高分子构像的动力学；可测定多种原子核，如，可测定多种原子核，如，H1、C13、P31、N14等。等。AVANCE ICE 600