发酵技术中的补料的控制.doc

发酵技术中补料控制
补料分批发酵(fed-batch culture, FBC):
又称半连续培养或半连续发酵, 是指在分批发酵过程中, 间歇或连续地补加一个或多个成份新鲜培养基培养方法, 是分批发酵和连续发酵之间一个过渡培养方法, 是一个控制发酵好方法, 现已广泛用于发酵工业。
1 FBC作用
1） 能够控制抑制性底物浓度
高浓度营养物抑制微生物生长:
① 基质过浓使渗透压过高, 细胞因脱水而死亡;
② 高浓度基质能使微生物细胞热致死(themal death), 如乙醇浓度达10％时, 就可使酵母细胞热致死;
③ 有是因某种或一些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用, 如高浓度苯酚(3％～5％)可凝固蛋白;
④ 高浓度基质还会改变菌体生化代谢而影响生长等。
v 有基质是合成产物必需前体物质, 浓度过高, 就会影响菌体代谢或产生毒性, 使产物产量降低。如苯乙酸、 丙醇(或丙酸)分别是青霉素、 红霉素前体物质, 浓度过大, 就会产生毒性, 使抗生素产量降低。
v 有底物溶解度小, 达不到应有浓度而影响转化率。如甾类化合物转化中, 因它们溶解度小, 使基质浓度低, 造成转化率不高。
v 采取FBC方法, 能够控制合适基质浓度, 解除抑制作用, 得到高浓度产物。
2） 解除或减弱分解代谢物阻遏
v 有些合成酶受到快速利用碳源或氮源阻遏, 如葡萄糖阻抑纤维素酶、 赤霉素、 青霉素等多个酶或产物合成。经过补料来限制基质葡萄糖浓度, 就可解除酶或其产物阻遏, 提升产物产量。
v 缓慢流加葡萄糖, 纤维素酶产量几乎增加200倍; 将葡萄糖浓度控制在0.02％水平, 赤霉素浓度可达905 mg／L; 采取滴加葡萄糖技术, 可显著提升青霉素发酵单位等。这都是利用发酵技术处理分解代谢物阻遏实际应用。在植物细胞培养中, 也采取该技术来提升产量。
3）能够使发酵过程最好化
v 分批发酵动力学研究, 说明了各个参数之间相互关系。利用FBC技术, 就能够使菌种保持在最大生产力状态。
v 伴随FBC补料方法不停改善, 为发酵过程优化和反馈控制奠定了基础。
v 伴随计算机、 传感器等发展和应用, 已经有可能用离线方法计算或用模拟复杂数学模型在线方法实现最优化控制。
FBC优点:
v ①解除底物抑制、 产物反馈抑制和分解代谢物阻遏;
v ② 避免一次投料过多造成细胞大量生长所引发一切影响, 改善发酵液流变学性质;
v ③ 可提升发芽孢子百分比, 控制细胞质量;
v ④ 不需要严格无菌条件, 产生菌不易老化变异, 比连续发酵适用广泛。
2 补料内容
① 能源和碳源;
② 氮源;
③ 微量元素;
④ 诱导物;
3 补料标准
标准: 依据菌体生长代谢规律;
生产需要;
环境条件
方法: 充足而不过量（少许数次或分批流加）
4 补糖控制
补糖时机
v 过早, 刺激生长, 加速糖利用;
v 过迟, 所需能量跟不上。如谷氨酸发酵在对数生长久末期补料。
判定: 培养基条件, 菌种, 发酵情况（残糖, pH, 菌形态等）, 在需要时加入;
举例: 四环素, P203图10-14
补糖方法
v 连续流加: 每次流加又可分为快速流加、 恒速流加、 指数速率流加和变速流加。
v 少许数次间歇补入
v 大量少次补入

可与其她组分一起进行多组分补料。
以不引发发酵液成份猛烈波动为前提;
补糖量——加入与消耗平衡, 维持稳定糖浓度;
例:
a 四环素发酵还原糖维持在0.8-1.2%
b 谷氨酸追加糖液发酵: 在原工艺基础上, 加大接种量到10%, 增加生物素用量达5μg/L, 降低初糖浓度（12%——7-8%）立刻取得大量生产型菌体, 当菌体处于生长对数期后进入产酸期, 糖浓度在2%左右时, 连续流加糖液, 维持2%左右糖浓度。
优点: 低浓度发酵, 以利于生长和发酵;
     总糖浓度达20%, 产酸高。
Ø 补糖开始时, 不仅CRR、 OUR大幅度提升, 连RQ也提升约10％, 表明经过补糖不仅提供了更多碳源, 而且伴随体系内葡萄糖浓度提升, 糖代谢相关酶活力也提升, 产能增加。
Ø 发酵中后期为确保产生次级代谢产物, 有意使菌体处于半饥饿状态, 在营养限制条件下, 维持产生次级代谢产物速率在较高水平。
5 赔偿氮源及无机盐
v 流加尿素, 首先调整pH, 其次补氮。
v 谷氨酸发酵时, 首次加入尿素量和补加量取决于菌种脲酶活力强弱和耐尿能力。
v 脲酶活力低, 耐尿素强, 首次加入用量多2%, 流加次数少
v 脲酶活力强, 耐尿素低, 首次加入用量少0.6%, 流加以少许数次好
6 补料控制
v 流加操作控制系统分为有反馈控制和无反馈控制两类。反馈控制系统是由传感器、 控制器和驱动器三个单元所组成。依据控制依据指标不一样, 又分为直接方法和间接方法。
v 间接方法: 以溶氧、 pH值、 呼吸商、 排气中CO2分压及代谢产物浓度等作为控制参数。对间接方法来说, 选择与过程直接相关可检参数作为控制指标, 是研究关键。通气发酵利用排气中CO2含量作为FBC反馈控制参数是较为常见间接方法。
v 直接法: 伴随一系列技术障碍克服, 该法将会得到快速普及。反馈控制FBC, 常常是依据部分指标来进行, 在很多情况下, 并不能奏效, 尚需进行多因子分析。
v FBC还可采取“放料和补料”(withdraw and fill)方法: 发酵一定时间, 产生了代谢产物后, 定时放出一部分发酵液(可供提炼), 同时补充一部分新鲜营养液, 并反复进行。
维持一定菌体生长速率, 延长发酵产物生产期, 有利于提升产物产量, 降低成本。注意染菌。
v 如控制青霉素生产所用葡萄糖流加质量平衡法, 就是利用CO2反馈控制。它是依靠正确测量CO2释放率CRR和葡萄糖流动速度, 达成控制菌体比生长速率和菌浓。
v pH值也可用作糖流加控制参数。
注意事项:
v 适宜料液比
v 无菌操作
v 碳氮平衡, 经济合理