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1、第二章 常规组织病理技术 活体组织检验: 活检目 l 帮助临床对病变作出诊疗或为疾病诊疗提供线索 l 了解病变性质、 发展趋势, 判定疾病预后 l 验证及观察药品疗效, 为临床用药提供参考依据 l 参与临床科研, 发觉新疾病或新类型, 为临床科研提供病理组织学依据 活检应用范围 l 帮助临床对病变作出诊疗或为疾病诊疗提供线索 l 了解病变性质、 发展趋势, 判定疾病预后。 l 验证及观察药品疗效, 为临床用药提供参考依据 l 参与临床科研, 发觉新疾病或新类型, 为临床科研提供病理组织学依据 活检标本类型 l 手术摘除器官、 组织, 如阑尾、 甲状腺、 胆囊、 淋
2、巴结等 l 穿刺抽取组织, 如肝、 肾、 淋巴结穿刺组织 l 自病变部位切取小块组织, 包含用纤维胃镜、 纤维支气管镜等内镜钳取病变组织 l 刮取组织: 刮出子宫内膜组织（诊刮）, 外科手术刮取病变骨组织等 活体组织标本固定与送检 l 固定 存放 送检 组织与细胞取材 l 一张好切片是确保病理诊疗和科研结果正确性前提和基础 与正确取材、 适宜固定和良好染色亲密相关 组织处理要求 完整保留组织细胞形态 最大程度保留组织或细胞成份抗原性 抗原不弥散, 以确保其正确定位 组织取材 （一）通常标准 l 厚度 0.2～0.3cm; 面积 1
3、～ 1.5cm2 l 较薄皮肤、 腔道器官及囊壁组织等应剪成细条缠绕成同心圆状 l 骨组织需先经脱钙处理 l 若需保留新鲜组织, 应将所取组织用锡箔纸包好, 浸入液氮速冻, 然后置-70℃冰箱中 （二）取材注意事项 刀剪应锋利、 避免前后拉动和挤压 l 避免使用有齿镊, 动作轻柔以免挫伤或挤压组织 l 避开坏死组织和血凝块, 去掉异物 l 取病变主体、 病变与正常交界和正常组织各一块 固定及常见固定剂 一、 概念: 将组织浸入一些化学试剂中, 使组织细胞内物质能尽可能保持其生活状态时形态结构和位置 二、 固定作用 1. 保持组织、 细胞与生活状态时相同结
4、构和形态, 预防组织自溶和细菌繁殖造成组织腐败 2. 保持细胞内蛋白质等成份凝固并定位于原有部位 3. 便于区分不一样组织成份: 固定可使组织细胞中多种成份沉淀、 凝固并易着色 4. 有利于切片: 固定剂兼有组织硬化作用, 能使组织细胞从半液体状变为半固体状 5. 有利于免疫组化染色和核酸原位杂交: 完整保留及正确定位抗原、 DNA和RNA成份 三、 组织固定注意事项 1. 取材后要立刻固定, 尤其是温度高季节, 以免腐败 2. 容器: 最好选择广口容器, 一是避免组织受挤压变形, 二是方便取材时易于取出 3. 固定液要足量, 最少应为组织块总体5倍以上 4. 依据不一样研究
5、目选择不一样固定液 Masson染色, 最好用甲醛升汞、 Zenker液或bouin液固定 l 保留细胞内糖原应选择Carnoy液固定 l 显示尿酸盐结晶可用100%酒精固定 5. 固定时间: 视组织块大小、 固定温度、 固定液种类而定 l 通常固定6小时以上, 然后保留于70%酒精中 l 温度低于4℃时, 固定时间应延长 l 比较大标本除延长固定时间外, 还应做多个切面固定, 以免固定不均匀 四、 固定方法 1. 浸泡法 2. 蒸汽固定法: 常见于固定组织中可溶性物质 3. 灌注固定法: 用于组织块过大或固定剂难以进入其内部标本（如整个器官、 整只动物）
6、4. 滴加法: 细胞涂片 5. 微波固定法（63 ℃ ～65℃）: 含有核膜清楚、 染色质均匀、 组织结构收缩小等优点, 但因为其固定时间不易掌握, 通常不主张利用于小组织块固定 常见固定液及其配制 （一）单纯固定液: 由单一化学物质组成 1. 甲醛 （1）优点: 价格廉价、 组织穿透力强、 固定均匀、 组织收缩小, 可长久保留标本 （2）缺点: 易挥发, 有一定毒性 （3）性质: 交联性组织固定剂 （4）适用范围: 适合多个特殊染色, 对脂类和类脂体、 神经及髓鞘都有良好固定效果; 也可固定高尔基体、 线粒体和糖类 （5）使用浓度: 10% formalin, 即10ml市
7、售原液（40%）加90ml水, 此液甲醛实际浓度为4% 2. 中性甲醛 以pH7.2～7.4磷酸缓冲液（PBS）为溶剂配制甲醛溶液, 浓度同前 l 优点: 固定效果及对组织抗原保留均优于通常甲醛溶液 l 是科研用组织最常见固定液 3. 乙醇 （1）优点: 含有硬化、 固定、 脱水等作用, 还能保留糖原和尿酸结晶 （2）使用浓度: 固定组织用80%～95%为好, 70%乙醇可用于保留组织; 证实尿酸结晶和保留糖原用100％浓度 （3）缺点: l 组织渗透力较弱 l 能沉淀白蛋白、 球蛋白和核蛋白, 核蛋白沉淀后能溶于水, 使核染色不良 l 高浓度乙醇固定组织硬化显
8、著, 组织收缩显著且脆, 既影响切片, 又致组织形态改变, 影响诊疗 l 溶解脂肪、 类脂质和血红蛋白, 还损害其它色素 （二）混合固定液: 由多个化学物质混合组成 1. A-F液 酒精-甲醛固定液 l 固定兼脱水, 固定后可直接入95%酒精脱水 l 配制方法: 95%以上浓度酒精90ml, 40%甲醛10ml, 混合而成 2. Bouin液 （1）优点: 渗透力强, 对组织固定均匀, 收缩很小, 不会使组织变硬变脆, 适适用于睾丸活检等小组织固定 （2）固定时间: 小块组织只需数小时, 较大脏器固定12～二十四小时 （3）配制方法: 苦味酸饱和水溶液75ml, 40%甲醛
9、水溶液25ml, 冰醋酸5ml 80%酒精150ml, 40%甲醛60ml, 冰醋酸15ml, 加入结晶苦味酸1g（用前配制） 3. Zenker液 （1）优点: HE染色最好固定液, 此液固定标本, 胞核和胞质染色清楚 （2）固定时间: 12～二十四小时 （3）缺点: 配制该液试剂较昂贵, 且需处理汞 （4）配制方法: 重铬酸钾2.5g, 升汞5.0g, 蒸馏水100ml l 将升汞、 重铬酸钾和蒸馏水混于烧杯中, 加热（40～50℃）溶解, 冷却后过滤, 贮存与棕色瓶中 l 临用时取贮存液95ml, 加入冰醋酸5ml 4. Carnoy液 l （1）优
10、点: l 穿透力强, 能很好地固定胞质和染色质 l 尤其适合固定外膜致密组织 l 在固定组织同时, 能溶解大部分脂肪 l 用于糖原及尼氏小体固定 l 对显示DNA和RNA效果很好 （2）固定时间: 小块组织固定1～2小时 （3）配制方法: 无水乙醇60ml, 冰醋酸10ml, 氯仿30ml。 （4）缺点: 氯仿有毒 组织脱水、 透明 浸蜡和包埋: 切片前处理过程, 关键目是便于切薄片和长久保留组织块 一、 脱水 l 用一些溶媒（脱水剂）置换组织内水分过程 l 脱水剂必需能与水任意百分比混合 l 常见脱水剂: 有乙醇、 丙酮及叔丁醇（2-甲基-2-丙醇 ） l
11、丙酮引发组织收缩作用强而较少应用 l 为了降低组织急剧收缩, 应使用从低浓度到高浓度递增次序进行, 通常从70%浓度开始, 经80%、 95%直至无水乙醇 二、 透明 l 组织块中水分被透明剂所替换, 组织块变得透亮过程 l 最常见透明剂为二甲苯, 因其既能与酒精混合, 又能溶解石蜡 l 处理时间通常为30min左右 l 其它透明剂: 苯、 甲苯、 氯仿、 环己酮、 苯甲酸甲酯、 香柏油、 冬青油和苯胺油等 三、 浸蜡 l 组织透明后在熔化石蜡内浸渍, 让蜡液完全渗透入组织细胞内过程 用于浸渍石蜡熔点为52℃～56℃ 浸蜡时间通常为3小时, 需更换3次石蜡
12、液 浸透或透入: 用其它浸透剂（火棉胶、 碳蜡、 明胶等）渗透组织内部过程 四、 包埋 组织块经过浸蜡或浸透后, 再用包埋剂包起来过程 l 包埋后组织块含有一定硬度和柔韧性, 有利于切薄片 l 常见包埋剂: 石蜡、 火棉胶、 碳蜡、 明胶和塑料等, 可依据不一样研究需要选择 一、 石蜡切片 厚度: 3～5μm 漂片附贴（40℃恒温热水中完全展开） 烘片: 56～60℃, 经30～60min 石蜡切片注意事项 用于DNA提取石蜡切片通常为5 ～10μm, 用小镊子夹入微量离心管中, 每管可装5 ～10片 切片过程中应严格注意预防标本间交叉污染, 以
13、避免假阳性 应避免刀痕、 皱折和残缺 二、 冷冻切片 适用范围: 快速病理诊疗、 酶组化染色、 苏丹Ⅲ染色等 厚度: 6～8μm 适应症 l 确定病变性质 l 确定切除肿瘤边缘是否有残余肿瘤组织以明确手术范围 l 识别手术切除组织 l 确定切除淋巴结内有没有转移肿瘤细胞 不宜作冷冻切片诊疗情况 l 骨、 脂肪、 钙化显著组织 l 组织太少太小标本 l 需依据核分裂计数判定良恶性软组织肿瘤 l 疑为恶性淋巴瘤者 l 其她 风险及可能后果 l 冷冻切片诊疗因为取材有限 l 制片方法特殊 l 染色质量差 l 诊疗时间短等不足
14、 l 临床应用有一定风险性 冷冻切片病理诊疗知情同意书 l 难免有出现误诊可能性, 病理医师将承受极大压力 l 应该由临床医师、 病理医师和患者共同来负担这种风险 l 让患者知道自己可能面临多种结果, 有权接收或拒绝该项检验 常见病理染色技术及其应用 一、 苏木素-伊红染色 HE染色, 被称为常规染色 l 能很好地显示组织结构和细胞形态 l 保留时间长 l 应用广泛 1. 染色步骤（略） 2. 结果显示: l 细胞核呈蓝色; 细胞质、 肌肉、 结缔组织、 红细胞和嗜伊红颗粒呈不一样程度红色 l 钙盐和多种微生物也可染成蓝色或紫蓝色 3.
15、 注意事项 l 切片脱蜡应根本 l 依据染片多少和染液新鲜程度掌握染色时间长短 l 分化处理要适度 l 染色后酒精脱水应遵照从低浓度到高浓度, 由快到慢, 梯度脱水 l 染色要求切片色泽鲜艳, 明亮清楚 二、 常见特殊染色方法及其应用 （一）结缔组织染色 结缔组织含有三种纤维: 胶原纤维、 网状纤维和弹力纤维 它们在HE染色时不易区分, 特染可判别 1. 胶原纤维染色 目: 判定梭形细胞肿瘤起源: 判定心肌瓣痕灶、 早期肝硬化、 肺纤维化以及其它纤维组织增加或降低性病变等 常见方法: Masson三色染色法 结果: 胶原纤维呈蓝色, 肌纤维和红细胞呈红色, 细胞核为蓝
16、褐色 注意事项: l Masson复合染色液经磷钨酸分化时须在显微镜下控制至肌纤维清楚为止 l 苯胺蓝可用亮绿染料替换, 此时胶原纤维染成绿色 2. 网状纤维染色 l 目: 显示网状纤维和基底膜 l 用于判别 l ①上皮性与非上皮性肿瘤 l ②一些间叶组织肿瘤 l ③判定原位癌与早期浸润癌 l ④观察肝组织网状支架塌陷、 破坏或增生等改变 l 常见方法: Gomori银染色法 结果: 网状纤维呈黑色, 胶原纤维呈红色, 背景呈黄色 注意事项: ①配制氨性银溶液必需将器皿洗洁净, 所用蒸馏水要纯 ②加氨水要适量, 宜现用现配, 以免银盐析出, 影
17、响染色结果 ③氧化液存放时间不能长, 以免失去氧化作用 ④丽春红复染液通常须滴染, 无水乙醇冲洗时要将切片倾斜, 以防染液停留在切片上而造成组织中胶原纤维分布不均假象 3. 弹力纤维染色 l 目: l 观察皮肤组织增殖改变 l 老年性肺气肿纤维断裂、 变性或萎缩 l 高血压病时小动脉管壁弹力纤维异常增生 l AS动脉管壁弹力纤维崩解、 断裂与缺失 l 试验动物组织中血管壁损害和增生情况 常见方法: 醛品红弹力纤维染色法 结果: 弹性纤维呈深紫色, 底色为不一样程度黄色 注意事项: l ①醛品红染液要置冰箱内保留, 用时恢复至室温 l ②橙黄G液要淡染, 不然会掩
18、盖弹力纤维深紫色 （二）糖类染色 单糖和双糖 多糖: 淀粉、 纤维素、 糖原 黏多糖: 中性黏液物质和酸性黏液物质 1. 糖原染色 l 目: l ①明确细胞内空泡性质 l ②糖原贮积病诊疗 l ③一些透明细胞肿瘤判别诊疗 l ④低分化腺癌诊疗 l ⑤早期浸润癌判定 l ⑥肾小球肾炎分类诊疗 常见方法: PAS染色法（过碘酸-Schiff） 结果: 糖原及其它PAS阳性反应物质呈红色, 细胞核呈蓝色 注意事项 ①组织固定要立刻, 取材要小, 以免糖原颗粒居于细胞一端 ②配制Schiff液重亚硫酸钠质量必需纯 ③Schiff液应置冰箱内保留, 用时取出恢复室温
19、后再进行染色 ④应设对照片（用唾液或1%淀粉酶消化后染色） ⑤染色时间示温度而定, 夏季短, 冬季长 2. 粘液物质染色 目: 粘液性上皮肿瘤判别, 证实肿瘤内是否有粘液 l 常见方法: Alcian blue-PAS染色法 l 结果: 中性粘液物质呈红色, 酸性粘液物质呈蓝色 注意事项 ① Alcian blue染色时, 玻片上不能涂白胶或火棉胶, 以免背景着色 ②染PAS时采取滴染法, 用过试剂不能再用 3. 组织中脂类显示法 l 目: l ①判别细胞内空泡性质, 对一些肿瘤诊疗有意义 l ②显示胆固醇沉积、 脂肪栓塞、 先天性类脂质沉积病 l 常见方法: 苏丹Ⅲ染色 l 结果: 中性脂肪呈橙红色 注意事项 ①固定剂应避免用有机溶剂 ②用冰冻切片或碳蜡包埋切片 ③切片宜厚, 多在6～10μm, 过薄脂质会丢失 ④配好染液要密封保留, 染时要在有盖玻璃器皿内进行, 以免染液沉淀, 造成切片污染 4. 神经纤维及髓鞘染色 （1）神经纤维染色 目: 显示神经纤维 l 常见方法: Holmes染色法 l 结果: 神经纤维黑色, 背景灰色 l 注意事项: 组织用升汞固定能促进染色 （2）髓鞘染色 目: 显示髓鞘 常见方法: Weil染色法 结果: 髓鞘呈蓝黑色, 背景呈淡灰色
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