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噬菌体展示技术解析
噬菌体展示技术经过近发展和完善, 已被广泛应用于抗原抗体库建立、 药品设计、 疫苗研究、 病原检测、 基因诊疗、 抗原表位研究及细胞信号转导研究等。噬菌体展示系统模拟了自然免疫系统, 使我们有可能模拟体内抗体生成过程, 构建高亲和力抗体库。因为噬菌体展示技术实现了基因型和表型有效转换, 使研究者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体外控制, 从而为获取含有良好生物学活性表示产物提供了强有力手段。另外, 噬菌体展示技术已成为不经过免疫获取特异性人源抗体新路径, 为获取对人类和动物疾病有诊疗和诊疗价值单克隆抗体提供了关键手段。
应用面这么高大上, 那么原理到底是什么呢？那接下来将由小编为您揭开其神秘面纱!

一、 噬菌体展示技术原理
噬菌体展示技术（phage display）是将多肽或蛋白质编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因合适位置, 在阅读框正确且不影响其她外壳蛋白正常功效情况下, 使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表示, 融合蛋白随子代噬菌体重新组装而展示在噬菌体表面。展示到噬菌体表面多肽或蛋白保持相对独立空间结构和生物活性, 能够与靶分子结合和识别。噬菌体展示肽库或蛋白库与固相抗原结合, 洗去未结合噬菌体, 然后用酸碱或者竞争分子洗脱下结合噬菌体, 中和后噬菌体感染大肠杆菌扩增, 经过3-5轮富集, 逐步提升能够特异性识别靶分子噬菌体百分比, 最终取得识别靶分子多肽或者蛋白。下图粗略展示了技术筛选过程:

二、 噬菌体展示系统分类
1.M13噬菌体展示系统
M13噬菌体属于单链环状DNA病毒, 其基因组为6.4 kb, 编码10种蛋白, 其中5种为结构蛋白, 包含关键衣壳蛋白PⅧ 和次要衣壳pⅢ 、 pⅥ 、 PⅦ 和PⅨ 。其中, pⅢ 和PⅧ 是噬菌体展示中最常见两种蛋白, 构建了pⅢ 和PⅧ 展示系统。pⅢ 蛋白分子量为42 kDa, 分布在噬菌体颗粒一端。通常一个噬菌体有3-5个拷贝pⅢ 蛋白, 可在N端柔性连接区插入外源蛋白或者多肽。pⅢ 系统关键优点是对展示外源蛋白大小无严格要求, 该系统能够用来展示分子量较大蛋白。PⅧ 蛋白分子量为5.2 kDa, 关键分布在噬菌体颗粒两侧。因为该蛋白分子量很小, 只适适用来展示外源短肽。外源肽段太大会影响病毒包装, 不能形成有功效噬菌体。但因为pⅢ蛋白拷贝数较多, 该系统比较适适用来筛选低亲和力配体。

2.λ噬菌体展示系统
λ噬菌体是长尾噬菌体科一个温和噬菌体, 有直径55nm二十面体头部, 末端有细长尾丝。基因组为48.5 kb线性双链DNA分子, 有黏性末端即单链延伸12个核苷酸, 感染后线性基因组可立刻环化。噬菌体头部由D蛋白和V蛋白组成, 能够构建D蛋白和V蛋白展示系统。λ噬菌体是在宿主细胞内完成装配, 无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外, 可展示有活性大分子蛋白质(100 kDa以上蛋白质)及宿主细胞有毒性蛋白质, 适用范围极广。

3. T4噬菌体展示系统
T4 噬菌体基因组DNA 为双链线形, 呈环状排列, 噬菌体衣壳有两种非必需外壳蛋白: SOC(small outer capsid protein)和HOC(highly antigenic outer capsid protein)。T4 噬菌体表面展示是将外源多肽或蛋白质分别与SOC位点C末端和HOC 位点N末端融合而展示于T4 噬菌体表面。T4噬菌体关键优点是能够实现SOC位点和HOC位点同时展示, 展示拷贝数也较多。

4. T7噬菌体展示系统
T7 噬菌体基因组为线性双链DNA, 其衣壳蛋白通常有两种形式, 即10A(344个氨基酸残基)和10B(397个氨基酸残基), 10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面, 所以被用来构建噬菌体展示系统。T7噬菌体展示系统能够高拷贝展示50个氨基酸多肽, 以低拷贝量(0.1-1/噬菌体)或以中拷贝量(5-15/噬菌体)展示1200个氨基酸残基多肽或蛋白质。所以, 广泛应用于筛选不一样分子量, 不一样亲和力蛋白质。

三、 噬菌体展示技术应用
1. 抗体筛选
将抗体可变区基因插入噬菌体基因组中, 表示抗体展示到噬菌体表面, 构建噬菌体展示抗体库, 能够在体外模拟抗体生成过程, 筛选针对任何抗原抗体。相对于杂交瘤技术, 经过噬菌体展示抗体库技术筛选抗体, 能够不经过免疫, 缩短抗体生产周期。也能够筛选在体内免疫原性弱, 或者有毒性抗原抗体, 适用范围广。噬菌体展示抗体库技术不受种属限制, 能够构建多种物种抗体库。从人天然库中筛选到抗体, 能够不经过人源化过程, 直接用于抗体药品研究。

2. 新受体和配体发觉
将多肽序列展示到噬菌体表面, 取得噬菌体展示多肽库。用细胞作为筛选靶标, 经过差异筛选, 取得出识别特定细胞多肽。经过研究该多肽序列, 能够深入得到细胞表面特异性表示受体蛋白。用HCT116细胞筛选12肽库, 从库中筛选出了能够特异性行识别结肠癌细胞多肽。深入分析分析发觉, 该多肽能够特异性识别a-enolase。该蛋白有望作为结肠癌诊疗靶标, 筛选结肠癌诊疗药品。取得多肽序列, 也能够作为抗癌药品运输载体。

3. 蛋白质相互作用研究
蛋白质相互作用是生命过程中所不可缺乏, 噬菌体展示多肽文库是由特定长度短肽序列组成。用靶蛋白质(如受体)对该文库进行亲和淘选, 就能够取得与之结合短肽序列。对所得序列测序分析, 并合成对应短肽, 从而能够来研究两个蛋白质之间相互作用。利用这种方法已经成功判定出多个关键大分子, 如生长激素受体、 胰岛素受体、 胰岛素样生长因子受体和TNF-a 受体激动剂和颉颃剂等。

4. 抗原表位分析
用抗体作为筛选蛋白, 从噬菌体展示多肽库中, 筛选出能够与抗体特异性结合噬菌体, 经测序分析, 取得该抗体识别抗原表位。该技术为抗原抗体反应机制研究, 诊疗试剂开发, 疫苗制备等提供依据。
现在表位判定技术能够实现:
①单抗药品及诊疗用单抗制备;
②研制包含“通用”目标在内诊疗性和预防性重组多价肽疫苗;
③研制单表位或重组多表位肽检测抗原;
④筛选基于表位基序疾病、 肿瘤等新特异诊疗标志物;
⑤高通量发觉同源蛋白中全部保守性和特异性表位;
⑥筛选功效性抗体表位或者抗体中和性及可及性表位;
⑦为表位水平分析病毒遗传进化和变异, 提供抗原漂移和转移直接证据。

5. 抗体人源化改造
单抗人源化百分比不停升高, 单抗药品靶位逐步多样化, 除了传统细胞表面抗原, 还包含了常见细胞因子, 部分研制中单抗药品甚至能够识别多个抗原表位, 而且单抗药品结构也不限于完整单抗分子。联合小分子等诊疗方案逐步增加, 日益受到医疗工作者重视。所以, 作为一个高科技含量药品, 单抗药品企业科技水平决定了其竞争力, 也决定了药品诊疗效果和市场价值。

6. 双特异性抗体（BsAb）制备
经过基因工程手段将两个分别靶向不一样抗原抗体片段组合在一起, 含有两种抗原结合位点, 能够发挥协同作用, 进而提升诊疗效果。不过双特异性抗体种类较多, 选择时依据最终应用来做判定。

7. 酶抑制剂筛选
β- 酮脂酰ACP 还原酶是原核生物脂肪酸生物合成代谢中高度保守和广泛存在酶, 用此蛋白为筛选靶蛋白, 从噬菌体肽库中筛选出了该酶抑制剂, 能够作为新型抗菌剂。已针对乙酰胆碱酯酶、 海藻糖酶、 乙酰乳酸合成酶、 乙酰CoA 羧化酶和谷氨酰胺合成酶等靶标酶, 开发和研制了一系列高效杀虫剂和除草剂。

8. 蛋白质定向改造
蛋白质定向改造是指用盒式突变、 错误倾向PCR等方法来突变蛋白质或者结构域某一特定编码序列, 产生蛋白质或结构域突变文库展现在噬菌体表面, 经过亲和筛选择得所需已定向改变噬菌体克隆, 她们一级结构能够从DNA序列中推导出来, 可用来筛选含有更强受体结合能力细胞因子、 新酶抑制剂、 转录因子DNA结合新位点、 新细胞因子拮抗剂、 新型酶和增强生物学活性蛋白质等。

三、 金开瑞噬菌体展示定制服务类型
1. 天然/免疫抗体库构建（人、 小鼠、 兔、 羊驼等）
2. 抗原表位判定
3. 蛋白质相互作用研究
4. 抗体筛选
5. 抗体人源化
6. 抗体亲和力成熟
7. 重组抗体改造
武汉金开瑞生物工程有限企业引进了成熟优异噬菌体库筛选专利技术, 并经过多年积累经验, 不停优化筛选方案, 极大提升了试验正确度, 为很多药企及科研单位都交付了非常满意答卷, 金开瑞强大噬菌体团体已经建立了一个综合抗体药品研发平台, 从抗体发觉、 到抗体测序、 工程化改造到大规模制备, 完美地整合抗体生产和抗体工程技术, 以满足用户单克隆抗体药品研发及科研生产需要, 伴随该技术不停发展和创新, 该技术应用范围和能力将会得到更大发展, 在这条道路上, 您并不孤独, 武汉金开瑞金开瑞生物工程有限企业将会与您携手同行, 尽最大能力助您一臂之力!

参考文件:
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