松材线虫病检测技术及普查方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,松材线虫病检测技术及普查方法,湖北省森林病虫害防治检疫总站,1,松材线虫病检测技及术普查方法,松材线虫病简介,松材线虫病检测技术,松材线虫病普查方法,2,分类地位,松材线虫属垫刃目(,Tylenehida)，,滑刃科(,Aphglenchoididae),伞滑刃属(,Bursaphelenchus)。,3,松材线虫病,分布与危害,松材线虫病是由松材线虫（,Bursaphelenchus xylophilus,),寄生在松树体内而导致树木迅速死亡的一种毁灭性病害。,美国早在,1934,年在路易斯安娜州一个锯木厂的长叶松中分离到的线虫。1972年日本的真宫和清原确定了松树萎蔫病的病原为线虫，并将其命名为松材线虫(,Bursaphelenchus lignicolus)。,目前分布于加拿大、墨西哥、日本、韩国、中国、葡萄牙、尼日利亚等多个国家，其中以日本受害最重。,4,松材线虫病,分布与危害,我国自,1982,年在南京发现该病以来，目前此病害已分布于江苏、安徽、广东、广西、山东、浙江、湖北、湖南、重庆、福建、贵州、江西、云南、四川、陕西等,15,个省份,(,港澳台未统计在内）的部分松林。松材线虫病对我国森林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏。该病已列于我国森林病虫害之首。,5,松材线虫病,分布与危害,该病危害的毁灭性在于致病力强，寄主死亡速度快；传播快，且常常猝不及防；一旦发生，治理难度大。它不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生态环境，对我国丰富的松林资源构成严重威胁。,6,松材线虫病,寄主,松材线虫的寄主种类均为针叶树，其中以松属树种为主，非松属树种很少。据国内外资料记载，自然条件下感病的松属树种有36种，其中我国有9种：日本赤松(,Pinus densiflora,)、,日本黑松(,P.thunbergii,)、,马尾松(,P.massoniana,)、,白皮松(,P.bungeana,)、,海岸松(,P.pinaster,)、,火炬松(,P.taeda,)、,黄松(,P.thubergiimassoniana,)、,7,寄主,湿地松(,P.elliottii)、,硫球松(,P.luchuensis)；,非松属树种有8种：香脂冷杉(,Abies balsamea,)、,欧洲云杉(,Picea excelsa,)、,加拿大云杉(,P.canadensis,)、,北美云杉(,P.pungens,)、,欧洲落叶松(,Larix europaea,)、,美加落叶松(,L.americara,)、,雪松(,Cedrus daeodara,)、,大西洋雪松(,C.atlantica,),等几十种松杉树上。,(,其中最容易感病的是黑松，在我省松材线虫病已发现在马尾松、黄山松、华山松三种松树上发生,),。,8,松材线虫病,症状和发病过程,松树,受松材线虫侵染后，植株迅速枯死是松材线虫病的重要特点。被松材线虫侵染后，整个植株失水，蒸腾作用降低，同时树脂分泌急剧减少、停止。无论是对自然感病株还是人工接种株的观察，其外部症状都表现出针叶失去光泽，经过短时间灰绿、黄绿的过程迅速变为黄褐色，乃至红褐色，同时陆续从局部波及整个植株，最后整个植株枯萎、死亡。,9,松材线虫病,症状和发病过程,受松材线虫侵染针叶当年不脱落。被松材线虫侵染后的植株木质部往往由于兰变菌的存在而呈现兰灰色。,一般从出现外部症状至死亡约11.5个月。病株在显示外部症状之前914天，流脂量就显著下降到微量或根本无流脂。病害多在7、8、9月份流行。大多数病株当年死亡，少数翌年死亡。,10,症状和发病过程,根据症状及发病过程可以对松材线虫病进行初步诊断，进而可以取样进行线虫分离。在尚未出现外部症状之前可以根据流脂量的变化进行早期诊断。用手摇钻在高11.3,m,树干处钻一直径1,cm,的小洞，深至木质部，2小时后观察流脂情况。健康树流脂量大，树脂充溢，而病树流脂少，甚至无流脂出现。此外，发病时间和死亡速度也是很重要的诊断依据。当然，少数植株，或在温度较低地区的植株也可能当年感病，翌年死亡。,11,松材线虫病,症状和发病过程,松材线虫病的重要特点是病树迅速死亡。根据病树的死亡时间，可将该病的症状分为三种类型：,1.,当年枯死,型,：,多数情况下，植株感病后，于当年秋季表现全株枯死。在高温干旱时，植株从线虫侵入到枯死只需要,3,个月左右，从开始出现症状到死亡大约,30-45,天。,典型病害症状的出现，大体上可分为,4,个阶段：,12,松材线虫病,1,）病害初期，植株外观正常，但树脂分泌开始减少；,2,）树脂停止分泌，蒸腾作用减弱，树冠；部分针叶失去光泽、变黄，此时，一般能观察到天牛或其它甲虫侵害或产卵的痕迹；,3,）,多数针叶变黄，植株开始枯萎，这时，可以发现甲虫的蛀屑；,4,）整个树冠针叶由黄色变为褐色或红褐色，全株枯死，针叶当年不落。,13,发病,4,个阶段的典型病害症状,第一阶段 第二阶段,14,发病,4,个阶段的典型病害症状,第三阶段 第四阶段,15,松材线虫病,症状和发病过程,2,、越年枯死,型,：,在温度较低地区，有约,10%,松树感病后，当年不迅速枯死，而是次年春或初夏才枯死。,3,、枝条枯死,型,：,在不利发病条件下，植株感病后，在,1-2,年时间内，并不表现全株枯死现象。一般仅为树冠上少量枝条枯死，随时间推移，枯死枝条逐渐增多，直至全株。,16,松材线虫病,生物学特征,松材线虫由卵发育为成虫，期间要经过龄幼虫期。雌、雄虫交尾后产卵，雌虫可保持,30d,左右的产卵期，条雌虫产卵约,100,粒。在生长最适温度,(25),条件下约,4d,代，发育的临界温度为,9.5,高于,33,则不能繁殖。由卵孵化的幼虫在卵内即脱皮次，孵出的幼虫为龄幼虫。秋末冬初，病死树内的松材线虫已逐渐停止增殖，并有自然死亡，同时开始出现另一种类型的龄幼虫，称为分散型龄虫，进入休眠阶段。第二年春季，当媒介昆虫松褐天牛将羽化时，分散型龄虫脱皮后形成分散型龄虫，特称为,dauerlarvae(DL),，即休眠幼虫,(,耐久型幼虫,),。,17,松材线虫病,生物学特征,这个阶段的幼虫即分散型龄、分散型龄幼虫在形态上及生物学特性上都与繁殖阶段不同，如角质膜加厚、内含物增多、形成休眠幼虫口针、食道退化。这阶段幼虫抵抗不良环境能力加强，休眠幼虫适宜昆虫携带传播。,18,松材线虫病,生物学特征,松材线虫的媒介昆虫松褐天牛在华东地区一般为年代；广东年代，以代为主。在我们湖北地区年代，春天可见松材线虫分散型龄虫明显地分布在松褐天牛蛀道周围，并渐渐向蛹室集中。这主要是由于蛹室内含有大量的不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸、棕油酸等对线虫产生趋化活性。当褐松天牛即将羽化时，分散型龄虫脱皮形成休眠幼虫，通过松褐天牛的气门进入气管，随天牛羽化离开寄主植物。,19,松材线虫病,生物学特征,松材线虫对二氧化碳有强烈的趋化性，天牛蛹羽化时产生的二氧化碳是休眠幼虫被吸引至气管中的重要原因。在松褐天牛体上的松材线虫均为休眠幼虫，多分布于气管中，以后胸气管中线虫量最大。此外也会附着在体表及前翅内侧。只天牛可携带成千上万条线虫，据记载最高可达,280,万多条。当松褐天牛补充营养时，大量的休眠幼虫则从其啃食树皮所造成的伤口侵入健康松树。,20,松材线虫病,生物学特征,松褐天牛在产卵期线虫携带量显著减少，少量线虫也可从产卵时所造成的伤口侵入寄主。休眠幼虫进入树体后即脱皮为成虫进入繁殖阶段，大约以,4d,代的速度大量繁殖，并逐渐扩散到树干、树枝及树根。,被松材线虫侵染了的松树大抵是松褐天牛产卵的对象。翌年松褐天牛羽化时又会携带大量线虫，并接种到“健树”上，如此循环，导致松材线虫的传播。,21,松材线虫病,传播途径,一是自然传播。在自然条件下，松材线虫的扩散主要是依靠传媒天牛的自然活动进行的。目前认为松材线虫从传媒天牛传播到寄主松树，传媒天牛携带松材线虫飞出病树后，在健康松树上补充营养取食时，松材虫从传媒天牛气管爬出，并从天牛取食时在松枝上造成的伤口侵入到松树体内。自然传播的速度是较慢的。,22,松材线虫病,传播途径,二是人为传播。带有松材线虫和,传媒天牛的病材、病枝及其加工制品等人为携带或运输工具等传入到另一地区。这种传播方式不受自然屏障限制，而且速度快，是最主要、也是最危险的传播方式。,23,松材线虫病,松材线虫、松天牛、松树三者之间的生物联系,松材线虫和传媒天牛以松树寄主，离开了松树等寄主植物，松材线虫和传媒天牛在自然条件下很难长久存活，松材线虫和传媒天牛共同寄生在松树体内，两者为其共生关系。,24,松材线虫、松天牛、松树三者之间的生物联系,没有松褐天牛等媒介传播，松材线虫病很难转移危害，松材线虫使松树树势衰弱，流脂减少或停止，提高了传媒天牛卵及幼虫的成活率，使传媒天牛的种群增加，促进了松材线虫病的进一步扩展；传媒天牛、松材线虫不断地相互促进，加快了松林的毁灭速度。,.,带有传媒天牛和松材线虫病死木经人为传播和传媒天牛迁飞，造成新的疫点和新一轮侵染循环。,25,接种28天后的黑松苗和对照,（倒“,T”,法）,26,病害发展过程2-(1)7月9日,病害发展过程2-(2)8月7日,27,松材线虫为害状（马尾松）,28,松材线虫为害状（黑松）,29,松材线虫病,松天牛的分布及生物学,在亚洲无论是我国，还是日本和韩国，松材线虫最重要的传播媒介均为松褐天牛。在日本已发现9种天牛携带松材线虫，除松天牛外还有：(,M.nitens,)(,白斑墨天牛)、(,Acalolepta fraudatrix,)(,锦天牛的一种)、(,Arhopalus rusticus,)(,褐幽天牛)、(,Corymbia succedanea,)(,红花天牛的一种)、(,Uraecha bimaculata,)(,双斑泥色天牛)、(,Spondylis buprestoides,)(,短角幽天牛)、(,Acanthocinus griseus,)(,小灰长角天牛)。,30,松材线虫病,松天牛的分布及生物学,此外，在北部地区分布较多的(,M.saltuarius,)(,云杉花黑天牛)与当地松材线虫传播有关。在美国发现携带松材线虫的天牛有：(,M.Carolinensis,)(,卡墨天牛)、(,M.scutellatus,)(,白点墨天牛)、(,M.titilator,)(,南美松墨天牛)、(,M.obtusus,)、(,M.mutator,),和褐幽天牛等。但其中只有松褐天牛是重要的传播媒介。,31,松褐天,牛的各,种虫态。,32,松褐天牛雌虫（左）和雄虫（右）,33,松褐天牛正在,取食松树嫩枝。,34,松树嫩枝被松褐,天牛取食的痕迹。,1,2,35,松褐 天牛,产卵刻槽（下）,和羽化孔（上）,36,被松褐天牛和松材线虫,为害致死的松树木段。,37,松材线虫病检测技术,直观检查,在林中进行病害调查时，观察病株是否具有松材线虫病外部症状，即针叶变为黄褐色乃至红褐色，植株干枯，媒介昆虫或其栖居痕迹，诸如取食痕迹、产卵痕、侵入孔、羽化孔等。在调运检疫时直接和借助于锯、斧等工具对应施检疫物根据来源观察是否存在木质干枯、木质部兰变和媒介昆虫或它的栖居痕迹等症状。,38,松材线虫病检测技术,室内检验,a、,抽样和取样：,在调运检疫时抽取有上述症状的部分检疫物，抽样数量为每批次总件数的0.5-5.0%，但最低不得少于5件。若无明显症状时可随机抽样。在进行病害调查时，则选取有松材线虫病症状的样株，根据具体情况砍取木段或钻取木屑进行室内检验。,39,松材线虫病检测技术,在所选取的样木（样品）或样株上钻取少量木屑约10,g，,每样3个重复。取样时要注意选取靠近蛀道、蛹室的部位，所取样品不得带有树皮。对所取样品标号后带回实验室检验。必要时可将整件样木(或样品)带回实验室备检。,b、,分离线虫：,将各标号样品分别进行线虫分离。,40,松材线虫病检测技术,分离线虫可采用贝尔曼(,Baermann),漏斗法或浅盘法。对媒介昆虫进行线虫分离时，可将其用剪刀或尖头镊子、解剖针等剪碎或撕碎后同样采用上述方法进行。分离时若室温较低(不得低于7)可根据室温高低将分离用水调至2040(不得超过40)后浸泡分离材料34小时线虫游离出一定数量后即可镜检。一般情况24小时后镜检。,41,松材线虫病检测技术,贝尔曼(,Baermann),漏斗法：,将大小适当(直径1015,cm),的漏斗末端接一段长约10,cm,的乳胶管后置于漏斗架上，在乳胶管上装一止水夹。剪大小适当纱布两层铺在漏斗上。将带到实验室的样段去皮后劈成长约34,cm,的细条或钻取木屑，约取小木条(或木屑)10,g,置于漏斗上的纱布中，将纱布四角向中间盖上分离材料，然后,42,松材线虫病检测技术,注入清水浸没。注入清水后要注意使水充满漏斗和下面的乳胶管，不要产生空隙。镜检时，用培养皿在漏斗末端接取线虫分离液约515,ml,即可。,43,贝尔曼(,Baermann),漏斗法分离线虫,44,浅盘法分离线虫,45,松材线虫病检测技术,浅盘法,:,浅盘分离装置主要由两只不锈钢浅盘组成，其中口径略小的一只底部为粗网筛，放在另一只浅盘上面。将两层纱布打湿铺于筛盘上，把样品劈碎(或木屑)置于筛盘的纱布上，慢慢注入清水，使水浸没样品。分离结束后，移去筛盘，把大盘内的分离液集中于小烧杯内。小烧杯内的线虫分离液可通过自然沉降或离心机(,l500,转/分，离心23分钟)浓缩至适宜的量，以便镜检。,46,c、,镜检：,分别将各标号盛有线虫分离液的培养皿置于解剖镜下观察，先确认有无线虫。对有线虫的样品进行活体检验，观察它的一般形态结构。然后尽量选择几条成熟、特征易观察的线虫，用针或吸管移至载玻片上的水滴中，使之沉底。将此载玻片在酒精灯火焰上方往返几次，约56秒至虫体突然伸直时停止，加盖玻片后在显微镜下观察。根据形态特征予以鉴别，以确定其是否为松材线虫。分别记录检验结果。记录的主要内容和形式可参照松材线虫检验记录表。,47,批号,样号,检 验 日 期（年、月、日）,干枯,蓝变,松天牛栖居 痕 迹,有无线虫（+、）,备注,检验人,松材线虫检验记录表,48,松材线虫病检测技术,（3）鉴定,a、,线虫的培养：,鉴定需要相当数量的雌雄成虫，但在检验时分离到的线虫往往是处于休眠阶段的分散型3令虫；有时虽可见雌雄成虫，但数量较少；而从媒介昆虫分离到的线虫则只能是被称为休眠幼虫(,DL),的分散型4令虫，因此，需将上述情况的线虫进行培养，以获得大量雌雄成虫供鉴定。,49,松材线虫病检测技术,真菌上的单异活体培养：,通常用于培养松材线虫的真菌为灰葡萄孢(,Botrytis cinerea,),或多毛孢(,Pestalotia sp.,)。,此外用镰刀菌(,Fusanum sp.,),培养松材线虫效果亦佳。将真菌菌种接至马铃薯琼脂培养基(,PDA),平板或试管斜面上，在25条件下经过4至5天，待菌丝铺满平板或斜面后即将经过表面消毒的线虫用吸管接到菌丝上。之后，在28条件下培养1015天即可繁殖出大量线虫。用少量清水将线虫充分洗至小烧杯内备用。,50,样木保温保湿培养：,将样木劈开、锯成小段，置于烧杯中，加少量清水，使木段下端浸在水中，木段上端用湿纱布覆盖，在26培养箱中培养34天，倒取杯底水液，亦可获得较多的雌雄成虫。,接种线虫的表面消毒：,分离后获得的线虫悬浮液离心(1500转/分)23分钟浓缩至离心管底部，吸去上清液，用无菌滴管将底部线虫液约2,ml,移至另一无菌离心管内，加入2,ml,双倍浓度的消毒液，轻轻振荡混匀，一定时间后再离心浓缩，重复消毒1次，再用无菌水换洗2次即可。,51,松材线虫病检测技术,松材线虫表面消毒常用的消毒剂有：,(,a)3%,双氧水，处理10分钟；(,b)1%,升汞，处理5分钟；(,c)0.002%,放线菌酮和0.1%硫酸链霉素混合液，处理5分钟；(,d),硫酸链霉素(1000,ppm)、,金霉素(30,ppm),和匹玛霉素(,pimafucin,0.63ppm),混合液，处理5分钟等。培养后的大量雌雄成虫则可通过形态观察进行鉴定。而对于新发生区还需要作进一步的鉴定工作。,52,（2）临时玻片的制作,a、,杀死和固定：,将盛有线虫悬浮液的小烧杯置于65水浴中2分钟杀死线虫，经离心浓缩后即用三羟基乙胺福尔马林固定液(,TAF),固定。,b、,制片：,在洁净的载玻片上滴1小滴水，水滴大小以加盖玻片后恰好充满盖玻片下的空间为宜。在解剖镜下挑选经固定后的雌雄成虫各两条，摆在水滴中并使其沉没，从水滴的一侧缓缓加上盖玻片，避免出现气泡，用熔化的蜡烛或指甲油封片。,53,（3）虫体测计,根据德曼氏(,De Man),公式分别测量虫体上各个特征器官的长短和位置，用不同的符号来表示，一般雌雄虫各测2060条，取平均值。,L=,体长(微米),c=,体长/尾长(自虹门至尾尖),b=,体长/头端至食道和肠连接处之长,a=,体长/最大体宽,V(%)=(,头端至肛门之长/体长)100,St=,口针长度（微米）,sp=,交合刺长度(微米),54,松材线虫病检测技术,（4）鉴定标准,分类地位：,松材线虫,Bursaphelenchus xylophtIlus(Steiner et Bukrer),NickJe,属滑刃科(,Aphelenchoididae,)，,伞滑刃属(,Bursaphelenchus,)。,它与滑刃属(,Aphelenchoides,),的线虫很相似。在形态上两个属的主要区别是伞滑刃属线虫的雄虫尾部为一小的交合伞所包裹，而滑刃属线虫的雄虫无此交合伞。,55,松材线虫病检测技术,形态特征：,成虫虫体细长，约,lmm。,头部唇区高，溢缩显著，口针细长，基部略微增厚，使口针基结清晰。中食道球卵圆形，占体宽的2/3以上，食道腺细长叶状，覆盖于肠背面。排泻孔的开口大致和食道与肠交接处平等。半月体在排泻孔后约2/3体宽处。,雌虫热杀死后体态呈开阔“,C”,形。尾部亚圆锥形，末端钝圆，少数有微小的尾尖突(不超过2微米)。,56,松材线虫病检测技术,卵巢1个，前伸，卵呈单行排列，阴门开口于虫体中后部约73%处，开口处有后伸的宽的阴门前唇(阴门盖)覆盖。后子宫囊长，约为阴肛距的2/3。,雄虫热杀死后体呈“,J”,形，尾端尖细，侧观呈爪状，向腹部弯曲，为卵形交合伞所包裹(腹面观)。交合刺大，弓状，成对，喙突显著，交合刺远端膨大如盘状。,57,松材线虫病检测技术,繁殖型幼虫虫体前部和成虫相似。无生殖器官。虫体后部则因肠内积聚大量颗粒状内含物，以致呈暗色，结构模糊。幼虫尾部亚圆锥形，末端圆，或有难以看清的极短的尾尖突分散型3令虫和繁殖型3令虫比较，角质膜显著增厚，内含物显著增多，肠内积聚类脂小滴。分散型4令虫(,DL),除角质腊增厚、内含物增多外，它没有口针，食道退化，头圈丘形，尾端明显指状，体表覆有保护性胶粘物。,58,幼虫尾部亚圆锥形，末端圆，或有难以看清的极短的尾尖突,。,松材线虫的形态特征,A.,雌虫,B.,雄虫,C.,雄虫尾部,D.,雄虫尾部腹面观，端生的交合伞,E.,雌虫阴门,FH.,雌虫尾部,59,2,3,5,4,1,3,松材线虫的主要形态,1、雌虫唇区（14526）2、雌虫尾尖突（10304）3、雌虫唇片（14663）4、阴门（16085）5、交合刺（9815）,60,雌虫阴门,上覆以阴,门盖,61,雄虫交合,刺弓状，,尾部向腹,面弯曲，,尾端包有,卵形交合,伞。,62,（5与拟松材线虫（,B.mucronatus,）,在形态上的主要区别,拟松材线虫与松材线虫虽然在致病力上相差悬殊，但在形态以及生物学诸方面却很相似，且由于拟松材线虫分布更为广泛，因此在检验时常常可见，在鉴定过程中易混淆。,两者从形态上的鉴别主要依据雌虫尾形的不同，拟松材线虫雌虫尾部呈圆锥形，尾端指状，有明显的尾尖突，长约3,.8,至5,.7,微米。其幼虫尾部与成虫相似，尾尖突略短。对同样有尾尖突的松材线虫个体则以雌虫尾尖突长短来区分：尾尖突长约1微米(不超过2微米)的为松材线虫；尾尖突长达2微米以上的则为拟松树线虫。同样，也可利用幼虫尾部类似情况，作为鉴定的辅助手段。,63,拟松材线虫的形态特征A.,雌虫,B.,雄虫,C.,雌虫前端,D、E.,雌虫的尾部,F.,雄虫尾部,G.,雄虫尾部腹面观，端生的交合伞,H、I.,三龄幼虫的尾部,J.,休眠幼虫的尾部,K.,休眠幼虫的前端,64,拟松材线,虫雌虫尾,部圆锥形,，末端有,明显的指,形突。,65,松材线虫雌虫尾部亚圆锥形,66,松材线虫病检测技术,对于疫区来讲，通过形态观察基本上可以确定，但是在非疫区则需要作进一步的鉴定。此外，由于取样时间不同，样木部位不同，其线虫密度也有很大区别，这就导致有时分离到的线虫数量很少，或找不到成虫，无法确定其是否为松材线虫，也需要作进一步的鉴定。,67,表二 松材线虫与拟松材线虫尾形及尾尖突比较表,68a、,永久玻片标本的制作：,将23,ml,线虫水悬液置于43烘箱中12分钟杀死；加在同一烘箱中预热的福尔马林-甘油-蒸馏水(8：2：90)混合液固定24小时；加同样预热的苦味酸饱和液2滴后仍在同一烘箱内缓慢脱水。混合液不断地挥发，需及时添加放在同一烘箱内的混合液。为避免挥发过快，在盛线虫的玻皿上要加盖，或将玻皿置于培养皿中。这个过程一般需6至8周。,制片时选择特征显著的雌雄成虫及幼虫各1条置于载玻片的纯甘油滴中央摆好并使其沉底。将3根粗细和线虫体宽差不多的玻璃纤维呈三角形排列在甘油滴的外缘，甘油滴的量以加盖玻片后不外溢为宜。用中性树胶或硬甘油明胶冻封片两次，待第一次封片剂完全干燥后再封第二次b、TAF,固定液保存：,将热杀死后的线虫用,TAF,固定后置于青霉素小瓶中保存，每隔12年更换一次固定液，亦能达到,69,相对长久保存的目的。,2、利用指示剂在被检木木屑的有机溶剂提取液中的颜色反应进行快速检疫,通过国家林业局森防总站对我国江苏、安徽、浙江、广东4个疫区5种松树的试验结果表明：利用指示剂1号进行快速检疫检验，其准确率达黑松96%；马尾松为89%；赤松为100%；火炬松为92%；湿地松为59%。除湿地松（采自江苏）外，均已达到检疫检验所要求的准确程度，可操作性强，颜色反应直观，准确率高，简便快速，整个操作过程不超过15分钟，且多个样品可同时进行。,1)取样数量,每批总件数的0.5%5.0%，但最低不得少于3件。每件在任意3个部位分别用手摇钻或电钻钻取木屑约5克，标记。钻取木屑时要注意先把树皮剥净。,70,用,电,钻,钻,取,木,屑,71,2、样木乙醇提取液的制备,（1）配制70%80%的乙醇溶液,（2）样木乙醇提取液的制备,将钻取的木屑分别按标记装入各大试管中，倒入70%80%的乙醇溶液，乙醇在试管中的高度约为木屑高度的1.5 2倍，管口用脱脂棉紧密封塞。立即将试管置于水浴锅或保温瓶中的80 90的热水中，并使管中液体小沸10,min。,然后取出试管于冷水中冷却后备用。,（3）显色,取与试样对应数量的指形管，对应标号。分别取上述冷却后各试管中的上清液约2 3,ml,置入相应指形管中。然后用滴管分别滴入2滴事先选定的指示剂，摇匀，观察颜色变化，记录结果。,72,4、颜色比较,（1）,指示剂1号对几种松树病、健木乙醇提取液的颜色比较表,73,松材线虫病普查方法,1,调查组织与责任,1.1,县级负责组织普查人员，确定责任区，具体实施调查，样本初步鉴定。,1.2,市级负责参加重点区域调查，复检可疑样本，抽查核实县级普查结果，并对可疑新疫点进行复查。,74,松材线虫病普查方法,1.3,省级负责督察与技术指导，新疫情发生区样本检测、认定及疫情上报。,2,调查范围,各级组织普查单位所在地行政辖区内所有松林。重点是：交通沿线、风景区、厂矿、松木制品生产和 使用单位（木材加工点、木材市场、建筑工地、仓库、驻军营房、电视机及配件厂、纺织机厂、通讯站、电站、电视塔、光缆和电,75,松材线虫病普查方法,缆架设设区）等人为活动频繁地区附近的松林，特别是与疫区比邻地带、曾从有疫情分布的国家或地区调入松木及松木制品（如电缆盘、垫木、设备包装及铺垫材料等）的地方。,3,调查时间,每年春季,3-4,月和秋季,9-10,月份开展两次全面普查。,76,松材线虫病普查方法,4,调查内容,查明发生分布地点、范围、树种、发生面积、病死树数量，确定疫情分布边界，绘制疫情分布示意图、疫情分布详图。,5,统计标准,5.1,松材线虫病症状,：,5.1.1,针叶逐渐变为黄绿、黄褐、红褐色，整77,松材线虫病普查方法,株萎蔫枯死或部分枝条萎蔫枯死，针叶当年不脱落；,5.1.2,树干部多数有松褐天牛产卵刻槽、侵入孔；,5.1.3,树脂分泌减少、甚至停止，材质干枯有蓝变。,5.2,病株率：在发病面积内，按病株数除以松树总数乘以,100,计算，即：病株率,=,病株数,/,松树总株数,100,。,5.3,危害程度,5.3.1,纯林以病株率为指标，轻微一病株率低于 中等一病株率,O 1,-1,、严重,病株率高于,1,。,78,松材线虫病普查方法,5.3.2,混交林用发病范围涉及的小班面积、比例、病死树数量几个指标表示。,5.4,发生面积,5.4.1,纯林以小班为单位进行统计，无小班区划的以实际面积统计；,5.4.2,混交林折合成纯松林面积统计。,5.5,疫情发生点：有疫情发生的乡（镇）、国有林场。,5.6,疫情发生区：疫情发生点所在的县（市、区）。,79,松材线虫病普查方法,6,调查准备,6.1,各级组织、实施普查的单位结合当地实际制定具体实施方案。,6.2,有关资料及常用工具和仪器,1),行政区划图、森林资源分布图。,2),松林区的小班卡片。,3),发生区松材线虫病疫情分布现状图。,4),周边地区疫情发生情况、与疫区交往情况资料。,80,松材线虫病普查方法,5),调查表格,6),望远镜、手摇钻,(,钻头直径,10-15),或电钻、锯、斧或砍刀、塑料袋、标签、记号笔，生物显微镜解剖镜、玻璃漏斗、乳胶管、止水夹、离心机、培养箱、培养皿等。,7,调查方法,7.1,踏查 根据松林分布的特点和到当地访问乡镇林业员、农户等，初步了解本地松树死亡情况,81,松材线虫病普查方法,设计具体踏查 路线,7.2,在踏查中，发现可疑松树，应以林业小班为单位作进一步详查。,7.2.1,抽样,7.2.1.1,抽样对象的选取,7.2.1.1.1,对发现的枯死、濒死松树首先排除其它死亡原因（如人畜破坏、森林火灾、冻害、水渍及 其它病虫害等）。,7.2.1.1.2,查找是否表现松材线虫病典型外部症状。,82,松材线虫病普查方法,7.2.1.1.3,抽取尚未完全枯死或刚枯死不久的优势木（针叶呈黄绿或黄褐色，尚未完全枯萎，树皮尚 未脱落，材质尚未腐朽）。,7.2.1.1.4,抽样时可考虑以下因素：,a,）,7-8,月份病植株陆续表现感病的外部症状，,9-10,月份为发病高峰期（出现典型病死树最多），从出 现初期外部症状至整株死亡约,2,周。,b,）在林分中一般是优势木先发病,。,83,松材线虫病普查方法,C,）由于环境条件、接种线虫量、抗性差异等原因，一些松树仅部分枝条表现感病外部症状，这种现 象在混交林中表现的尤其明显。,d,）濒死树的针叶在小枝上下垂倒挂，当年不脱落。,E),不应将树干部有无松褐天牛危害状作为判定的必备条件，对不同时期出现的病死树应区别对待。,7.2.1.2,抽样数量 在一个小班内，可疑松树,10,株以下全部取样；,10,株以上先抽取,10,株，再选取其余数量的,1%,。,84,松材线虫病普查方法,7.2.1.3,现场填写,松材线虫病林业小班调查抽样记录表,。,7.2.2,取样,7.2.2.1,取样部位,a,）整株枯死的，在树干胸高处取样；如果胸高部位木质部材质新鲜、有松脂，或没有松材线虫病发 生记录的可疑点，在树干下部（胸高处）、中部（上、下部之间）、上部（主侧枝交界处）,3,个部位分别取 样；,85,松材线虫病普查方法,b,）仅部分枝条表现症状的，要在树干上部和枯死树枝上取样；,c,）在春季松褐天牛化蛹期，在蛹室周围取样。,7.2.2.2,取样方式,a已发生地区的可疑病株，剥净树皮和去除外围木质部，砍取,100-200,克木片，或用手摇钻从木质 部至髓心钻取同样重量的木屑。,b,）对没有松材线虫病发生记录地区的可疑罹病树，在取样部位分别截取,2-5cm,厚的圆盘。,86,松材线虫病普查方法,7.2.3,在样品上及时贴上标签（包括样品号、采集地点、树种、树龄、采集时间等）。,7.3,样品保存 样品应及时分离鉴定，若需要保存可采用以下方法,7.3.1,将木片或木条放入塑料袋内，扎紧袋口，在袋上扎几个小孔，放入,4,冰箱；,7.3.2,木段、圆盘可直接裹上几层湿纱布后放入,4,冰箱保存，若需保存时间较长，样品需经常喷水 保湿。,87,松材线虫病普查方法,7.4,样品检测 样品分离检测按中华人民共和国林业行业标准,松材线虫病检疫技术,（,LY/T1123-93,）中的有关规定 进行。鉴定结果填入,松材线虫病样品检测记录表,。,8,疫情确认,8.1,样品鉴定 按照分级负责的原则，先由县级森检机构初步鉴定，报市级森检机构复核。最后由省森检站确认。对 具有松材线虫病典型症状，经反复取样未检出松材线虫的松树，,88,松材线虫病普查方法,要及时填写,新疫情发生区（点）样品送 检表,和,疑似松树发生情况统计表,上报省站，并于次年跟踪取样检测，直至查明松树死亡原因。,8.2,疫情上报 有关单位及个人发现疫情或疑似疫情时，应立即向所在地的林业主管部门报告。所在地林业主管部门,3,日内核实后报告同级人民政府并逐级报送至省林业厅，省林业厅应在,2,个工作日内上报至省政 府和国家林业局。因瞒报和缓报造成疫情扩散者，追究主要责任人,89,松材线虫病普查方法,追究主要责任人责任。,9,疫情公布,我省疫情发生信息经国家林业局同意后，由省级林业主管部门发布。,10,普查结果上报,90,松材线虫病普查方法,每次调查结束后，各级森检站要及时对普查资料进行汇总，通过网上传输和邮寄逐级上报至省站检疫 科,10.1,上报时间,每年分别于,4,月底、,10,月底上报两次春季和秋季普查材料。,91,谢谢大家！,92,