毛细管电泳原理.pptx

毛细管胶束电动色谱原理SDS-+EOFMicellar Electrokinetic Chromatography(MEKC)七种青霉素的分离(A)CZE:20mM Pi-Borate,pH 8.5(B)MEKC:0.1 M SDS in(A)soln.胶束电动色谱的特点胶束电动色谱的特点 优点优点 增加对弱极性物质分离增加对弱极性物质分离的分离度的分离度 在中药分析、天然产物在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常分析、农药分析中经常使用使用 缺点缺点 稳定性不佳，达到好的稳定性不佳，达到好的重复性比较困难重复性比较困难第三章第三章 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 毛細管內先填充毛細管內先填充凝胶凝胶(例如例如polyacrylamidepolyacrylamide或或cellulose)cellulose)，此此时凝胶会时凝胶会在毛細管內形成分子在毛細管內形成分子筛，筛，样样品依分子量品依分子量的的大小在毛細管內移大小在毛細管內移动动速度不同速度不同而而进进行分行分离。离。主要用于核酸片断及蛋白分子量分析主要用于核酸片断及蛋白分子量分析毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳CE双链及单链核酸分析双链及单链核酸分析45-寡核苷酸质控寡核苷酸质控 1.0 2.0 3.0123 456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS21 10.0 15.0Relative Fluorescence IntensitydsDNA片段片段(72 bp-12 Kbp)CE-SDS蛋白分子量分析蛋白分子量分析第四章第四章 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦第五章第五章 亲和毛细管电泳亲和毛细管电泳-分离条件基于分离条件基于CZE 当在当在CZECZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，其他方面的选择与其他方面的选择与CZECZE等相同。等相同。用于研究用于研究1.分子间相互作用测定，分子构型变化分子间相互作用测定，分子构型变化2.特定物质检测特定物质检测3.活性物质筛选活性物质筛选ACE测定分子间结合常数与解离速率测定分子间结合常数与解离速率JAK2与与SH2-B之间的相互作用研究之间的相互作用研究CE药物筛选药物筛选ACE用于相互作用筛选用于相互作用筛选 适体适体AptamerAptamer类似于抗类似于抗体，但可以体外合成，体，但可以体外合成，结合常数比抗体更高，结合常数比抗体更高，有广泛的药物筛选和临有广泛的药物筛选和临床诊断应用潜力床诊断应用潜力 目前已有以下的一些蛋目前已有以下的一些蛋白的白的aptameraptamer是采用是采用CECE方法筛选得到的方法筛选得到的1.1.IgEIgE2.2.HIV type 1 reverse transcriptaseHIV type 1 reverse transcriptase3.3.ThrombinThrombin4.4.Anti-thrombin IIIAnti-thrombin III5.5.Taq DNA polymeraseTaq DNA polymeraseACE用于相互作用筛选用于相互作用筛选 传统筛选方法如亲和色传统筛选方法如亲和色谱或者谱或者CECCEC筛选一个筛选一个AptamerAptamer需要需要4-64-6周周 而而CECE只需要几天就可以只需要几天就可以了，大大提高了筛选速了，大大提高了筛选速度度-MicroScale Bioseparations 2006第六章第六章 检测器选择检测器选择小分子检测小分子检测大分子检测大分子检测CE检测器种类及性能检测器种类及性能小分子检测小分子检测1.1.有紫外吸收有紫外吸收 首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器2.2.无紫外吸收无紫外吸收 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等测器检测，如氨基酸、还原性糖等 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器测，也可以尝试电化学检测器3.3.有荧光或需要高灵敏度检测的可采用有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIFLIF检测器检测器4.4.需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测虑质谱检测大分子检测大分子检测1.1.蛋白、核酸蛋白、核酸 可以首先选择紫外检测器可以首先选择紫外检测器 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用方法标记荧光，然后用LIFLIF检测检测 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再后再LIFLIF检测检测 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测2.2.多糖多糖 含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测测 含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIFLIF、UVUV的方式检测的方式检测第七章 分离条件选择流程 分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考：第第一一步步，尽尽可可能能多多地地了了解解分分离离样样品品的的类类型型、来来源源、组组成成及其性质；及其性质；第第二二步步，根根据据样样品品的的可可能能性性质质和和来来源源，选选择择分分离离模模式式，若无样品信息可先选若无样品信息可先选CZECZE；条件选择流程 第第三三步步，根根据据样样品品性性质质确确定定检检测测方方法法，一一般般先先选选直直接接紫外吸收；紫外吸收；第第四四步步，确确定定样样品品处处理理方方式式，包包括括衍衍生生方方案案以以及及离离心心过滤除蛋白等；过滤除蛋白等；第第五五步步，根根据据样样品品解解离离常常数数计计算算最最佳佳pHpH，或或利利用用75mID75mID毛细管和磷酸缓冲体系确定毛细管和磷酸缓冲体系确定pHpH范围范围;条件选择流程 第第六六步步，根根据据所所需需pHpH构构建建缓缓冲冲体体系系，包包括括进进一一步步优优化化pHpH、缓冲试剂浓度等；缓冲试剂浓度等；第第七七步步，优优化化其其他他操操作作参参数数，如如毛毛细细管管尺尺寸寸、分分离离电电压压和和温度等；温度等；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂；第九步，确定是否需要换用其他分离模式。第九步，确定是否需要换用其他分离模式。