李斯特氏菌检测方法介绍—科标检测.doc

李斯特氏菌检测
李斯特菌（也称李氏杆菌）引发急性传染病, 以败血病为关键症状, 伴有内脏器官和中枢神经系统病变。李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死兔子体内首次发觉, 为纪念近代消毒手术之父、 英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912）, 1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。
单核细胞增生李斯特氏菌是一个人畜共患病病原菌。它能引发人畜李氏菌病, 感染后关键表现为败血症、 脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中, 食品中存在单增李氏菌对人类安全含有危险, 该菌在4℃环境中仍可生长繁殖, 是冷藏食品威胁人类健康关键病原菌之一, 所以, 在食品卫生微生物检验中, 必需加以重视。
李斯特菌在环境中无处不在, 在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、 蛋类、 禽类、 海产品、 乳制品、 蔬菜等都已被证实是李斯特菌感染源。李斯特菌中毒严重可引发血液和脑组织感染, 很多国家都已经采取方法来控制食品中李斯特菌, 并制订了对应标准。
科标检测在微生物检测领域拥有丰富经验, 能够针对食品、 医药、 化妆品、 农产品、 一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析, 为用户提供快速、 高效、 权威第三方微生物检测服务, 确保产品质量安全, 专业得到了中国、 国际著名企业广泛认可。

试验步骤
1. 增菌培养
将未开封测试片贮藏在≤8℃环境下, 并在包装上标示使用期内使用。在高湿度地方, 最好在使用前将测试片回复到室温。
取回样品应在4℃下处理、 存放和运输, 假如是冷冻样品, 则在检验前要保持冷冻状态。
取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）均质杯中进行均质, 然后转入三角瓶中, 30℃培养4h, 加入选择性试剂吖啶黄素、 萘啶酮酸和放线菌酮, 继续培养20h和44h.。
2. 分离
共培养24h和48h后, 取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3 LPM琼脂平板上划线。PALCAM琼脂可替换LPM琼脂。将OXA和PALCAM平板置于35℃培养24-48h, LPM平板在30℃培养24-48h。然后, 把LPM平板放于解剖镜载物台上, 以450角入射光从平板下面照射平板, 经过目镜垂直向下观察寻求可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽兰色或灰色。用已知阳性菌和阴性菌划线平板作对照。

已开封测试片, 将开口反折, 用胶带封好。
加入七叶苷和Fe3 LPM平板不用斜射光系统, 选择可疑菌落方法与在OXA上选择可疑菌落方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环, 其它菌也可形成黑色环, 但形成时间要在两天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上菌落特征相同。
在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多经典菌落, 分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、 更经典单个菌落。食品检验中在TSAYE平板上纯化是必需, 因为在PALCAM和OXA或LPM平板上分离菌落时可能沾有不可见受抑微生物。挑取5个经典菌落原因是一个样品中可能分离到一个以上李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培养24-48h, 假如不用于动力观察, 也可在35℃培养。
3. 判定步骤
为预防暴露于潮湿环境中, 请不要冷藏已开封测试片。将胶带封好测试片贮藏在低温干燥地方, 保持时间不超出1个月。请勿将测试片放在温度> 25℃和(或)相对湿度>50%环境中。
   1）观察TSAYE平板经过斜射光观察, 寻求呈兰灰至兰色菌落。在TSAYE上用已知菌作对照。
   2）从30℃或更低温度下培养TSAYE平板上挑取经典菌落做成湿玻片在油镜下观察。湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。假如菌量太少, 菌体黏附于载玻片上而展现非运动性。李斯特氏菌是细短杆菌, 可见轻微旋转及翻滚。与已知李斯特氏菌对摄影比, 球形、 大杆状且快速泳动都不是李斯特氏菌。
   3）挑取经典菌落进行过氧化氢酶试验, 李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。
   4）取16-24h培养物进行革兰氏染色, 李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。不过陈旧培养物革兰氏染色会发生改变, 而且菌体可成球形。在染色过重玻片上菌体有呈栅状排列趋势, 易误认为白喉菌而错判。

4. 用涂抹棒、 海棉或其它采样设备搜集环境样本。湿润采样设备液体应≤10 mL。湿润剂能够是无菌水、 缓冲蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW), 或中和缓冲液, 如Letheen肉汤或Dey/Engley (DE)中和肉汤。
   5）挑取经典菌落接种于TSBYE肉汤管中, 35℃培养24h用做糖类发酵和其它生化项目试验。TSBYE肉汤管在4℃下可存放几天, 也可反复接种。
   6）在TSAYE平板上挑取经典菌落刺种到5%绵羊血或马血琼脂平板上, 刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂, 同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌）, 35℃培养48h。单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小β-溶血环。
   7）在明亮光照下, 观察经穿刺血琼脂平板, 单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清楚β-溶血环, 英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象, 而绵羊李斯特氏菌产生界限显著较大溶血环, 在此不要试图进行种间区分, 但要统计下溶血反应特征, CAMP试验可区分它们间溶血反应。
   8）硝酸盐还原试验（选做）。用TSBYE肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中, 35℃培养5天后, 加入0.2mL试剂A, 再加入0.2mL试剂B, 混合, 出现紫红色为阳性反应, 表明硝酸盐已被还原, 如无颜色出现, 在试管内再加入少许锌粉, 放置1h, 如出现紫红色, 表明硝酸盐仍存在, 未被细菌还原。只有默氏李斯特氏菌还原硝酸盐, 所以, 从格氏李斯特氏菌中区分出默氏李斯特氏菌就必需进行这唯一试验。本试验还有一等效试验, 即加入0.2mL试剂A后, 再加入0.2mL试剂C, 出现橙色表明硝酸盐已被还原。如未出现颜色反应, 也加入少许锌粉, 若出现橙色表明硝酸盐未被还原。
5. 在无菌环境下在搜集样品中添加5 mL, 20-30℃, 灭过菌缓冲蛋白胨水(BPW)溶液。不要将Petrifilm EL测试片与Vermont 培养基(UVM)、 Fraser肉汤、 李斯特菌增菌培养基 (LEB)或缓冲李斯特菌增菌培养基BLEB)共用。
   9）将TSBYE培养物穿刺到SIM和MTM试管中, 室温培养7天, 每日观察, 李斯特氏菌呈经典伞状生长。在MTM中伞状生长更经典。同时, 30℃TSBYE培养物在油镜下可见细菌作翻转运动。
   10）将TSAYE肉汤培养物分别接种于0.5%（W/V）葡萄糖、 麦芽糖、 七叶苷、 甘露醇、 鼠李糖、 木糖发酵管内（可选择倒立发酵管）, 35℃培养7天, 呈阳性反应李斯特氏菌产酸不产气, 李斯特氏菌发酵鼠李糖和木糖情况见下表。全部李斯特氏菌对葡萄糖、 七叶苷、 麦芽糖均能发酵, 除格氏李斯特氏菌均不能发酵甘露醇。假如在OXA、 PALCAM或加七叶苷/Fe3 LPM分离平板上菌落色素很显著, 则七叶苷试验可免做。
6. 混合, 蠕动或旋转样品与BPW混合液快要一分钟。将样品置于室温(20-30℃) 1h, 最久不超出1.5 h, 以修复损伤李斯特菌。
将TSBYE肉汤培养物接种到3mLTSBYE肉汤中, 35℃培养24h, 接种2支TSAYE琼脂斜面, 35℃培养24h。用3mL0.01mol/l磷酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下, 菌悬液于80℃水浴中加热1h, 以2500r/min离心30, 弃去2mL上清夜, 将剩下液与沉淀混匀制成菌悬液, 进行血清学玻片凝集试验。