微生物基因组研究进展及意义.doc

微生物基因组研究进展及其意义
　　多年来, 病原微生物基因组研究取得了飞速进展。所谓基因组研究是指对微生物全基因进行核苷酸测序, 在了解全基因结构基础上, 研究各个基因单独或数个基因间相互作用功效。因为过去大家大多从表型分析入手, 寻求已知功效编码基因, 实际只了解微生物中极少数基因, 如链球菌链激酶基因、 结核杆菌编码热休克蛋白基因等。还有大量未知基因未被发觉。经过基因组研究, 则从根本上揭示了微生物全部基因, 不仅可发觉新基因, 还可发觉新基因间相互作用、 新调控因子等。这一研究将使人类从更高层次上掌握病原微生物致病机制及其规律, 从而得以发展新诊疗、 预防及诊疗微生物感染制剂、 疫苗及药品。另外, 新发觉微生物酶及蛋白还可能有在工农业生产上应用价值。所以, 全球除已完成了70余株覆盖关键病毒科病毒代表株全基因组研究外, 据美国基因组研究所（The Institute for Genomic Research, TIGR）报道, 现在已完成了19种微生物基因组测序, 其中11种与人类及疾病相关（嗜血流感杆菌, 生殖道支原体, 肺炎支原体, 幽门螺杆菌, 枯草杆菌, 伯氏疏螺旋体, 结核杆菌, 梅毒螺旋体, 沙眼衣原体, 普氏立克次体）。另外, 还有40余种微生物已被登记正在进行测序, 估计在1999～完成〔1〕。
病毒基因组研究进展
　　病毒因其基因组小, 是进行基因组研究最早生物体。早在1977年已完成了噬菌体DNA全基因测序。存在于脊髓灰质炎疫苗中SV40, 是最早完成全基因测序与疾病相关病毒; 以后, 很多病毒均已完成了全基因测序, 并依据序列开放阅读框架（ORF）对编码蛋白进行了推导。已对相当部分病毒蛋白进行了重组表示, 还对部分病毒基因编码调控序列进行了研究。除通常大小病毒已完成了基因组测序, 对大基因组病毒, 疱疹病毒科, 如水痘病毒基因组为0.125Mb(Mega-basepair,兆碱基对)〔2〕。巨细胞病毒, 基因组为0.229Mb〔3〕。中国已对痘苗病毒天坛株（约0.2Mb）进行了全基因测序, 发觉与国外痘苗毒株序列有显著差异〔4〕。中国还对甲、 乙、 丙、 丁、 戊、 庚型肝炎病毒进行了中国毒株全基因测序。最近还对中国2株发觉虫媒病毒毒株完成了全基因测序。中国从不一样起源标本中发觉了不少乙肝病毒变异株, 有含有特殊生物学特征〔5〕。对病毒基因中调控因子分析, 发觉了与乙肝病毒增强子作用新细胞核因子〔6〕。
　　所以, 现在对病毒基因组研究已进入了后基因组阶段, 即从全基因水平研究病毒生物学功效, 同时发觉新基因功效。对于医学病毒学目前关键方向是研究病毒基因组中与致病及诱生免疫应答相关基因, 从而揭示和处理迄今还未处理问题, 以达成控制或消亡部分关键病毒感染目。
　　提议现在可进行后基因组研究领域为:
　　1． 病毒连续性感染: 基因组中与连续性感染相关基因, 基因变异或调控因子研究。已报道乙肝病毒前关键基因出现终止密码突变, 可逃逸机体对E抗原免疫应答, 有利于病毒连续感染〔7〕。
　　2． 病毒与肿瘤关系: 已知EB病毒、 人乳头状瘤病毒、 乙肝病毒等均与肿瘤相关。对这些病毒基因组或基因变异研究, 有可能揭示部分致瘤机理, 如最近报道EB病毒LMP-1基因羧基端缺失30个碱基对, 可能含有更高致癌性〔8〕。
　　3． 病毒变异株或新出现毒株致病性改变: 如最近发觉肺出血性汉坦病毒〔9〕, 对人致病H5禽流感病毒以及复制性尤其强乙肝毒株〔10〕等, 对嗜性改变巨细胞病毒〔11〕从基因水平进行了研究。
　　4． 病毒编码复制酶基因及其调控研究: 有些病毒含有独特复制酶, 如对人免疫缺点病毒酶研究造成开发出有效抗病毒制剂。还有部分病毒（如丙型肝炎病毒）复制酶编码基因虽已明确, 但未能大量在体外表示, 而且对这些酶在细胞内病毒复制中所起作用也不清楚, 延误了抗病毒制剂开发, 应抓紧进行研究。
　　5． 病毒受体研究: 已知病毒受体多数是复合型, 最近发觉人免疫缺点型病毒受体除CD4外还有副受体〔12〕。受体是病毒入侵细胞第一关, 经过全基因组研究将更有利于发觉复合病毒受体。
　　总而言之, 本世纪后期已从基因组水平研究病毒功效〔13〕, 所以, 我们应注意将病毒基因研究关键转移到研究病毒基因与细胞相互作用中来, 以开辟对病毒致病机理研究宽广天地。

细菌基因组研究进展
　　广义细菌包含细菌、 衣原体、 支原体、 立克次体、 螺旋体及放线菌, 所以细菌基因组研究也包含这些微生物。除放线菌外, 细菌基因组大小为1至数个Mb。现在正在研究测序细菌已超出40余种。与致病相关关键细菌、 真菌及寄生虫, 参见表1。
表1　正在进行全基因组测序关键细菌、 真菌与寄生虫〔1, 14〕

细　　　菌
真　　菌
寄 生 虫
百日咳鲍氏杆菌
变异链球菌
白色念珠菌
利什曼原虫
空肠弯曲菌
肺炎链球菌
　(2株)
恶性疟原虫
鼠伤寒沙门杆菌
化脓链球菌
酿酒酵母菌
曼氏血吸虫
结核分枝杆菌
溶脲脲原体

布氏及克氏锥虫
肺炎衣原体
霍乱弧菌

卡氏肺孢子虫
沙眼衣原体
单细胞李氏菌

马来布鲁丝虫
艰苦梭杆菌
麻风分枝杆菌

土拉弗氏菌
鸟分枝杆菌

嗜酸乳杆菌
淋病奈氏菌

嗜肺军团菌
脑膜炎奈氏菌

伤寒沙门菌
绿脓假单胞菌

金黄葡萄球菌
构巢曲菌

　　1．细菌全基因组测序基础方法
　　因为细菌基因组通常在数百个kb至数个Mb, 快速测序策略用经典鸟枪法（shot gun）建立基因文库, 然后克隆测序。第一个完成全基因测序嗜血流感杆菌就是用此法完成。鸟枪法基础步骤为先将细菌染色DNA机械地切割成一定相对分子质量范围片段, 分别构建大小两套文库。小片段（1～2kb）经末端修补处理后克隆入如pUC18质粒载体内; 大片段（15～20kb）克隆入λ噬菌体载体中, 然后进行大规模测序。以后则需进行序列缺口填补。缺口填补是关键步骤, 通常需用多个方法相互组合才能完成, 花费时间及精力很多。能否完成缺口填补有时会成为完成全基因组测序关键。取得全基因组资料后, 还要利用计算机软件进行数据分析, 推测ORF是否为真实蛋白编码序列, 检验功效位点, 分析共有序列或特征序列（开启子, 信号肽, 保守基序conserved motifs）等。如不是私人企业支持研究, 全基因组研究资料将在杂志或互联网络上发表, 供科学界参考和使用〔15〕。
　　2． 细菌基因组研究所提供机遇和挑战
　　现在, 微生物界正面临在下一世纪中怎样发展严峻问题。在20世纪微生物学科为生命科学及人类健康作出了卓越贡献。全世界唯一被消亡天花, 痘苗发展及应用起了关键作用。因为微生物基因组较小, 将会超出其它生物愈加快地完成基因组结构与功效分析, 取得信息将会首先被应用于药品、 疫苗产品开发和疾病防治。比如最近对2株不一样幽门螺杆菌基因组分析和对比, 发觉1994年自美国分离菌株199与1987年自英国分离菌株26695, 仅有（6～7）％基因结构差异。这些不一样基因半数集中在一个高变区中。曾有学者认为, 幽门螺杆菌可引发不一样临床疾病但也可对人有利, 其机理可能与菌基因结构相关。现在结果揭示应关键研究这些菌株特异区基因, 同时应研究与定居基因表示相关序列, 另外还应考虑过去被忽略机体原因在幽门螺杆菌致病中地位〔16〕。经过对比幽门螺杆菌和最近完成全基因测序空肠弯曲菌, 发觉两种菌仅有17％不一样基因序列。其中, 幽门螺杆菌有独特基因使之能在胃酸存在条件下生存并分解尿素。弯曲菌则比螺杆菌有2倍多起调控作用基因。这些基因可能使弯曲菌能适应多个环境, 如人肠腔、 鸟肠道、 牛奶中。因弯曲菌能在外环境中生存, 在美国去年引发腹泻患者达30万人〔17〕。又如至今未能在体外培养梅毒螺旋体基因组为1 138 006bp, 其毒力因子由一个12个潜在膜蛋白家族和数个可能溶血素组成。对比梅毒与引发Lyme病螺旋体基因组, 也发觉了致病性很多基因〔18〕。结核杆菌基因组分析也已完成, 含4 411 529 bp, 编码约4 000个基因。发觉该菌有大量基因是编码脂类合成与分解酶, 发觉2个富含甘氨酸新家族, 可能是引发该抗原变异起源〔19〕。即使还未完成全基因组分析, 国外已对肺炎链球菌、 肠球菌和乳球菌关键基因序列进行了开发研究〔20〕。最值得我们重视是, 这是个新领域, 是能够进行创新研究高起点。
　　3． 怎样迎接挑战
　　过去中国微生物界老一代教授曾在学术上作出过卓越贡献。建国以来老中青学者们在反细菌战、 发展疫苗、 建立诊疗试剂等方面, 为控制传染性疾病取得了大量结果。所以开展微生物基因组研究含有较强实力。提议采取以下路线:
　　（1） 选择中国特有或对发展中国家影响大微生物, 进行基因组测序。因为中国经济实力有限, 只宜选择少数微生物进行。尽可能选择国外还未进行过微生物为对象。经过这项研究, 可使中国微生物界有少数骨干掌握细菌基因组研究策略和技术全过程, 有利于以后基因组功效研究开展。
　　（2） 对于已公布基因组要立刻掌握, 依据中国需要进行序列分析, 选择好有限目标对多个细菌作基因功效研究。应注意在基因功效研究中, 学习与借鉴病毒基因功效研究已经有经验。微生物学家不仅要将分子水平研究与细菌生物学特征相互联络, 还要联络临床及流行病学科、 药品学科、 生化学科和免疫学科。另外还需要建立适用细胞及动物模型, 以确保基因研究有后劲。
　　（3） 加强微生物界学者在细胞生物学、 生物信息学以及生物大分子学方面知识更新, 以适应微生物学科将面临革命性改变。估量以后微生物诊疗、 诊疗和预防都会有所改变, 及早作好准备方可立于不败之地。
　　编者评述: 科学家们预言二十一世纪在自然科学领域中, 生命科学仍占关键地位。关键将是研究人类基因组, 深入研究基因功效。微生物基因组研究较之人类基因组研究要简单部分, 但因为微生物种群繁多, 搞清其基因组功效亦非易事。20世纪70年代国外已开展了这方面工作, 这几年进展很快, 在开展基因核苷酸序列研究中, 中国也有不少结果在国际基因库登录。深入将开展研究其功效。本文概括地介绍了微生物基因组研究进展, 尤其是文章最终部分提出以后中国开展微生物基因组研究路线提议, 指出研究不仅要与国际研究接轨, 更关键是结合中国实际情况有所创新。微生物学科发展将面临革命化变革, 应及早有所认识。闻玉梅教授这篇文章给了我们启示。