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固定化酶制备及应用研究进展
摘要: 本文关键从分析酶单独应用中不足、 酶固定化载体、 固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中研究进展情况, 而且从医药、 食品、 环境保护、 化学工业、 能源等方面其在其中新应用出发, 对固定化酶在新领域中应用作了综述, 给固定化酶研究发展前景进行了展望, 而且指出了以后酶固定化研究关键方向是多酶固定化及制备高活性、 高负载、 高稳定性固定化酶。
关键字: 酶; 酶固定化; 载体; 酶固定化应用领域
酶是关键生物催化剂, 含有专一性强、 催化效率高、 无污染、 反应条件温和等特点, 在制药、 食品、 环境保护、 酿造、 能源等领域都得到了广泛应用。但在实际应用中, 酶也存在很多不足, 如大多数酶在高温、 强酸、 强碱和重金属离子等外界原因影响下, 都轻易变性失活, 不够稳定; 与底物和产物混在一起, 反应结束后, 即使酶仍有很高活力, 也难于回收利用, 这种一次性使用酶方法, 不仅使生产成本提升, 而且难于连续化生产; 而且分离纯化困难, 也会造成生产成本提升等。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用。伴随固定化技术发展, 出现固定化菌体。1973年, 日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中天门冬氨酸酶, 由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。固定化酶技术为这些问题处理提供了有效手段, 从而成为酶工程领域中最为活跃研究方向之一。本文将从酶生物催化剂固定化载体、 固定化方法和技术及固定化酶应用等多个方面出发, 归纳和综述这些方面多年来研究进展。
1酶固定化传统方法
关键在于选择合适固定化方法和必需载体以及稳定性研究、 改善。
1.1 吸附法
吸附法是利用物理吸附法, 将酶固定在纤维素、 琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、 离子交换树脂等载体上固定方法。显著特点是: 工艺简便及条件温和, 包含无机、 有机高分子材料, 吸附过程可同时达成纯化和固定化; 酶失活后可重新活化, 载体也可再生。但要求载体比表面积要求较大, 有活泼表面。
1.2 包埋法
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料格子结构或微囊结构等多空载体中, 而底物仍能渗透格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便, 酶分子仅仅是被包埋起来, 生物活性被破坏程度低, 但此法对大分子底物不适用。
1) 网格型
将酶或包埋在凝胶细微网格中, 制成一定形状固定化酶, 称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。

2) 微囊型
把酶包埋在由高分子聚合物制成小球内, 制成固定化酶。因为形成酶小球直径通常只有几微米至几百微米, 所以也称为微囊化法。

1.3 结正当
酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上经过离子键结合而使酶固定方法, 叫离子键结正当。其间形成化学共价键结合固定化方法叫共价键结正当。共价键结正当结协力牢靠, 使用过程中不易发生酶脱落, 稳定性能好。该法缺点是载体活化或固定化操作比较复杂, 反应条件也比较强烈, 所以往往需要严格控制条件才能取得活力较高固定化酶。
1.4 交联法
交联法是用多功效试剂进行酶蛋白之间交联, 使酶分子和多功效试剂之间形成共价键, 得到三向交联网架结构, 除了酶分子之间发生交联外, 还存在着一定分子内交联。多功效试剂制备固定化酶方法可分为: ( 1) 单独与酶作用; ( 2) 酶吸附在载体表面上再经受交联; ( 3) 多功效团试剂与载体反应得到有功效团载体, 再连接酶。交联剂种类很多, 最常见是戊二醛, 其她还有异氰酸衍生物、 双偶氮二联苯胺、 N, N-乙烯马来酰亚胺等。交联法优点是酶与载体结合牢靠, 稳定性较高; 缺点是有方法固定化操作较复杂, 进行化学修饰时易造成酶失活。
各类固定化方法特点比较:
比较项目
吸附法
结正当
交联法
包埋法
物理化学方法分类
物理吸附
化学共价键结合
物理离子键结合
化学键连接
物理包埋
制备难易
易
难
易
较难
较难
固定化程度
弱
强
中等
强
强
活力回收率
较高
低
高
中等
高
载体再生
可能
不可能
可能
不可能
不可能
费用
低
高
低
中等
低
底物专一性
不变
可变
不变
可变
不变
适用性
酶源多
较广
广泛
较广
小分子底物、 药用酶
2固定化载体要求
固定化酶载体应含有以下要求大致上有[1]:
1) 在酶催化反应过程惰性: 载体应不与底物、 产物及介质发生反应。
2) 有良好渗透性: 制备成柱子后, 能使底物和产物能快速经过降低吸附。
3) 有生物亲和性和相容性, 有利于酶活力发挥和稳定。
4) 有较高酶负载量, 载体表面能提供多个活性位点利于酶分子偶联。
3新型固定化技术
传统酶固定化方法虽在一定程度上能够增强生物催化剂稳定性, 但增强幅度有待深入提升, 而且在此过程中, 生物催化剂酶催化活力通常损失严重。利用现代高新技术和设计合成新型载体以及二者有机结合是引人注目研究动向。所以现在不停地有新载体和技术引入每固定化领域, 如: 无载体固定化、 微波/超声辅助固定化、 阳光照射、 离子液体, 电辅助固定化等等, 且固定化生物催化剂应用也越来越广泛地应用于医疗、 生物医药、 环境保护、 食品工业、 化学工业、 能源领域等。
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2
1.
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3.
3.1. 酶固定化过程中新载体
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2.
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3.1.
3.1.1 介孔材料
孔道结构和尺寸对酶活力及稳定性有着显著影响, 适宜孔道中酶固定化后其活力提升到游离酶2倍, 且三维及大孔道有利于固定化与催化过程中酶蛋白和底物、 产物传输, 从而能提升酶固定化和催化效果[2]。
现在, 大孔道、 高比表面和孔容新型介孔材料不停被引入酶固定化领域, 因为大孔道、 高比表面、 高孔容介孔材料中酶负载量大（图3）, 且酶负载能快速完成, 负载量显著提升。

图3 孔道大酶介孔材料酶负载量大显著提升
3.1.2 纳米管
碳纳米管( carbon nanotube, CNT)是由Iijima于1991年发觉一个新型纳米材料。它是由石墨片层卷曲而成无缝纳米管[3]。将生物分子, 如氨基酸、 蛋白质、 酶、 DNA 等结合在碳纳米管表面或端口上, 可提升它在水溶液中溶解度, 为实现碳纳米管多种生物应用奠定基础[4]。纳米管内表面能够与酶之间存在强烈相互作用, 从而使得管内酶蛋白结构稳定且保留相当催化活力, 而且用其制成电极能够有效实现底物氧化及电子传输[5]。硅纳米管用于固定化酶时, 能够保持酶活性, 而且提升酶热稳定性及对PH耐受性[6]。
3.1.3 磁性高分子微球
磁性高分子微球是由无机磁性纳米粒子与有机高分子经过包埋法、 单体聚正当合成含有磁响应性和微球特征粒子。经过共聚合和表面改性, 磁性高分子微球表面可被给予多个活性功效基团（如-OH、 -COOH、 -CHO等）。无机磁性纳米粒子应用较多是Fe3O4, 单体聚正当关键包含乳液聚合、 无皂乳液聚合、 微乳液聚合、 种子乳液聚合。磁性微球有良好表面效应和体积效应: 比表面积较大, 微球官能团密度较高, 选择性吸附能力较强, 吸附平衡时间较短; 选择磁响应性, 能够避免使用中粒子之间发生磁性团聚; 物理化学性质稳定, 含有一定机械强度和化学稳定性, 能耐受一定浓度酸碱溶液和微生物降解; 表面本身含有或经过表面改性给予多个活性功效基团, 这些功效基团能够连接生物活性物质[7]。
3.1.4 离子液体
离子液体是一个新绿色溶剂, 在生物催化反应中含有以下特点:在离子液体中酶有良好选择性、 稳定性和反应活性。离子液体可溶解极性大反应物, 产物易分离, 酶和离子液体可反复使用[8]。
离子液体是由有机正离子如烷基吡啶离子、 季胺盐离子、 烷基咪唑离子等和不一样负离子组成低熔点有机熔盐, 在室温或低温下是液体。离子液体和水、 常见有机溶剂能够互溶, 但和大多数醚、 烷烃不溶, 所以能够用醚、 烷烃来萃取产物。而且能够经过改变正负离子及烷基碳长短调整其极性和亲水性, 故又被称为可设计溶剂。Erbeldinger[9]小组首次报道在离子液体[BMIM][PF6]PH2O(95P5 vPv)中用蛋白酶thermolysin成功催化合成了阿斯巴甜(Z2aspartame)(图式4), 开创了在离子液体中生物催化研究新领域。

图式4 离子液体中蛋白酶thermolysin催化合成阿斯巴甜反应
3.2 酶固定化新技术、 新方法
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4.3
3.2
3.2.1 微波/超声辅助固定化
微波是一个电磁波, 波长为0.1~100 cm。微波加热关键原理是介质材料极性分子在微波高频电场作用下反复快速取向转动而摩擦生热, 是从物质内部开始, 瞬时达成需要温度。微波加热含有很多传统加热不含有优点, 包含: 加热快速、 均匀, 不需要热传导过程, 内外同时加热, 加热时间短; 加热质量高, 营养破坏少; 节能高效; 易于控制功效等
超声波是指振动频率大于20 kHz以上一个纵波, 在介质中传输时, 使介质发生物理和化学改变, 从而产生一系列超声效应, 包含热效应、 机械效应、 空化效应和化学效应[10]。研究认为, 超声波对液体化学反应速度和产率影响关键是超声波在液体介质中空化作用, 超声可使液体介质中形成微泡, 其破裂伴随能量释放, 能够提升很多化学反应速度。到现在为止, 超声波技术对物质提取, 高分子降解, 酶解反应等都有很好促进作用。其中超声波酶解反应含有高效、 廉价、 无污染, 可提升酶促反应速度和有效成份产率。
3.2.2 无载体固定化
交联酶晶体（cross-linked enzyme crystals, CLECs）是指经过交联剂, 如: 戊二醛, 将在水溶液中酶晶体交联成一个稳定结构及性能晶态物质, 其既含有酶高活性、 高选择性、 反应条件温和等特点, 又含有固相催化剂环境适应性强、 易回收等优势, 从而使其在有机合成中应有较广。CLECs是一个无需载体、 现有纯蛋白高度特异活性又对有机溶剂含有高度耐受性生物催化剂。因为CLECs需要高纯度酶结晶, 试验室难以实施, 所以其发展受到很大限制。
交联酶聚集体(Cross-linked Enzyme Aggregates, CLEAs)技术是一个将蛋白质先沉淀后交联形成不溶性、 稳定固定化酶, 是经过基础纯化、 高浓度蛋白质样品共价交联来实现。含有对酶纯度要求不高、 不需要结晶等复杂步骤、 可可取得稳定性好、 活性高、 成本低、 易于推广、 空间效率高等特点, 所以是一个很有发掘潜力固定化方法。
4固定化酶应用
固定化酶研究和应用不仅在化学生物学、 生物工程医学及生命科学等领域异常活跃, 而且因为含有节省能源与资源、 降低污染生态环境效应而符合可连续发展战略要求, 现在固定化酶已被广泛应用于医药领域、 食品行业、 化工行业、 材料科学、 环境保护领域、 能源领域、 蛋白质组学等领域。
4.
4.1. 医药领域
固定化脲酶: 脲酶是专一性催化尿素水解酶, 应用于尿素生产控制、 产品检验, 也广泛用于临床医学、 医学检验等, 脲酶固定化在血液透析中有着极佳应用前景。
固定化磷酸酯酶: 磷酸酯酶作用是催化水解低密度脂蛋白上磷脂酶, 加速体内低密度脂蛋白代谢。人体中低密度脂蛋白是关键血浆胆固醇载体, 因为其在体内代谢缓慢, 易形成高血浆胆固醇, 以至引发心血管疾病, 所以磷酸酯酶固定化能够应用于心血管疾病诊疗。
固定化葡聚糖酶: 葡聚糖酶常见于水解在血液替换品制备过程中产生右旋糖酐。
4.2. 食品行业
固定化酶应用于食品检测: 固定化酶技术发展使生物传感器也得到相当大发展, 它不仅使食品成份高选择性、 快速、 低成本分析测定成为可能, 而且生物传感器技术连续发展将很快实现食品生产在线质量控制, 降低食品生产成本, 并能够确保安全可靠及高质量食品[11]。
4.3. 生物传感器方面应用
在医学领域, 生物传感器因快速、 灵敏、 专一、 响应快等优点发挥着越来越关键作用。现在, 在检测多个细菌、 病毒及其毒素等多个方面生物传感器已经有较广泛应用。比如高精度血糖分析仪是采取固定化酶生物传感分析仪, 其分析精度能够达成0. 5%~ 2%, 比家用保健类生物传感器几乎高一个数量级, 比现在医用生化分析仪精度也高2%~ 3%。这在血糖分析领域是非常关键。
酶电极现已用于测定多种糖类、 抗生素、 氨基酸、 有机酸、 脂肪、 醇类、 胺类以及尿素、 尿酸等。
4.4. 环境保护
在环境监测方面, 固定化酶也能够用于测定有毒物质含量以进行环境监测。杨雪梅等选择硅胶、 活性炭、 大孔树脂, 在一定条件下用物理吸附法固定蛋白酶, 3种载体固定蛋白酶对含高浓度蛋白质淀粉黄浆废水进行水解试验, 发觉大孔树脂对蛋白酶效果良好, 并对含高浓度蛋白质废水处理效果最好[12]。
在废水处理中, 固定化酶也受到了越来越多科学家关注。生活污水和工业废水中有害成份关键是氯酚, 将辣根过氧化物酶大量吸附在磁石上, 能够确保其100%活力, 且净化效果是粗酶20多倍。
4.5. 能源利用
多年来不少学者为了处理能源紧缺问题致力于利用固定化脂肪酶催化合成生物柴油。高阳等研究了利用多孔渗水物质为载体固定脂肪酶, 使其可在低水环境中合成生物柴油[13]。
氢气作为一个清洁能源已引发大家关注。有学者利用聚丙烯酰胺凝胶包埋丁酸梭状芽孢杆菌IFO3847菌株, 能够利用葡萄糖生产氢气, 而且稳定性好, 无需隔氧。
5 结论与展望
（1） 制备高稳定、 高负载、 高活性固定化酶是酶固定化研究关键方向, 因为这么固定化技术应用能大大降低目标产物制备成本。
（2） 利用现代高新技术和设计合成新型载体以及二者有机结合是引人注目研究动向。
（3） 伴随多酶催化深入研究, 多酶固定化技术和多个固定方法结合技术开发将成为酶固定化领域关键内容之一。