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测定花青素、 多糖对自由基清除协同作用试验方案
一、 原理
多糖(polysaccharides)是由很多相同或不一样单糖以α-或β-糖苷键所连接而成结构复杂生物大分子化合物。20世纪60年代以来, 大家逐步发觉多糖含有多个生物活性, 如抗肿瘤、 免疫、 降血糖和降血脂等, 而且对机体几乎无毒副作用。它广泛存在于动植物和微生物细胞壁中。
原花青素(proanthocyanidins)是由单体黄烷-3-醇类物质以不一样聚合度连接而成多酚类化合物, 研究表明, 原花青素含有广泛生化和药理活性, 如抗氧化、 清除自由基、 护肝解毒、 抗菌及抗癌等功效, 现在已经成为医药、 保健品关键原料及食品 化妆品关键添加剂, 它广泛存在于多种植物核、 皮或种籽中
二、 材料、 仪器和试剂
1. 材料: 黑枸杞,由静乐县提供
2. 试剂: 二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、 儿茶素标准品;原花青素PC对照品（源自葡萄籽,纯度>95%）;香草醛,大孔吸附树脂HPD-200A、 HPD-400A、 HPD-700,聚酰胺30-60目;葡聚糖凝胶SephadexLH-20;色谱级甲醇、 乙腈、 醋酸;甲醇、 乙醇、 盐酸、 硫酸、 石油醚、 丙酮、 甲酸、 冰乙酸、 三氯乙酸、 正己烷、 正丁醇、 乙酸乙酯、 磷酸氢二钠、 磷酸二氢钠、 葡萄糖、 蒽酮、 茚三酮、 苯酚、 考马斯亮蓝、 氯化钠 三氯化铁、 氯化亚铁、 氯化钾、 无水氯化钙、 碘化钾均为国产分析纯。
3. 仪器:
粉碎机,分析天平,超纯水机,旋转蒸发仪,冷冻干燥机,真空干燥箱,紫外分光光度计,PB-10酸度计,BT-100恒流泵,DL-5M冷冻离心机,HH-6电热恒温水浴锅,恒温鼓风干燥箱,7200型可见光分光光度计,
超声波清洗器,JR-2集热式磁力搅拌器,高效液相色谱仪,高速冷冻离心机,气质联用仪,层析柱(2.5cm×50cm)
三、 试验过程: 参考
1. 材料预处理: 将黑枸杞放于烘箱中40℃条件下烘4h, 取出用粉碎机粉碎, 后置于干燥器中备用。
2. 提取方法:
1)正确称取一定量黑枸杞粉于100mL具塞三角瓶中, 在超声功率400W、 料液比为1:70（g:ml）、 乙醇浓度40%、 反应温度60℃等条件下提取30min, 冷却至室温
2）离心(5000r/min, 10min, 常温), 取上清液,
3）经旋转蒸发(60℃)浓缩至1/10体积左右, 然后加入4倍体积体积分数95%乙醇, 搅拌均匀后置4℃冰箱中12h,
4)离心(5000r/min, 10min, 4℃), 得上清液(原花青素粗提物)和沉淀物（多糖）。
3. 多糖、 花青素得率计算
1）多糖得率计算
a) 标曲制作:
称取干燥至恒重葡萄糖标准品10mg, 用去离子水定容到50mL, 配成0.2mg/mL葡萄糖溶液, 分别从中移取1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0mL定容到10mL, 以蒸馏水为空白对照, 取上述溶液1.0mL, 加入5mL蒽酮试液, 冰浴5min, 后置沸水浴10min, 取出后用自来水冷却2min, 静置10min后在627nm处测定其吸收值。
b) 样品得率测定
以葡萄糖浓度为纵坐标, 吸光度值为横坐标, 做回归处理, 得回归方程。将上述粗提取得到沉淀物用去离子水溶解并定容到50mL, 即为待测样, 以标准曲线法计算多糖含量。
多糖提取率/%=(C×V/1000m)×100
式中:c, 从回归方程中计算得出多糖浓度(mg/mL);
V, 多糖定容体积(mL);
m, 黑枸杞样品质量(g)。
2）原花青素提取率计算
a) 标曲制作:
称取2.5mg原花青素标准品, 体积分数60%乙醇定容到5mL, 然后吸收0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9mL定容到5mL, 分别从中抽取1mL加入2.5mL1%香草醛-60%乙醇溶液和2.5mL浓盐酸, 避光, 30℃水浴30min, 以60%乙醇为空白对照, 在500nm处测定吸收值。
b) 样品得率测定
以原花青素浓度为纵坐标, 吸光度值为横坐标, 做回归处理, 得回归方程。吸收上述粗提取得到上清液1mL, 以标准曲线法计算原花青素含量。
原花青素提取率/%C×V/1000m)×100
式中:c, 从回归方程中计算得出原花青素浓度(mg/mL);
V, 待测样总体积(mL);
m, 黑枸杞样品质量(g)。
4. 分别测定黑枸杞花青素、 多糖对自由基清除作用
a) DPPH标准曲线绘制:
正确称量0.025gDPPH于小烧杯中,加入适量蒸馏水和3ml甲醇溶解,
再于100mL容量瓶中用蒸馏水定容, 即得1000μmol/LDPPH标准溶液。将1000μmol/LDPPH标准溶液用蒸馏水分别稀释成100、 200、 400、 600、 800μmol/LDPPH溶液。用移液枪分别吸收0、 100、 200、 400、 600、 800、 1000μmol/LDPPH溶液各200μL于已加入7.8mLDPPH甲醇液10mL棕色容量瓶中。混匀后, 将其置于室温暗处反应60min, 然后在515nm处测定残留DPPH自由基吸光值。对照组设置为200μL甲醇溶液替换标准液。依据DPPH标准溶液浓度与已知浓度DPPH标准液对DPPH自由基抑制率绘制标准曲线。
b) DPPH自由基清除能力评价
依据Brand、 William等方法并略做修改。用分析天平正确称取0.0025gDPPH, 再用少许甲醇溶解并于100mL棕色容量瓶中用甲醇定容, 避光保留, 即得100μmol/LDPPH工作液。吸收4.8mLDPPH工作液于试管中, 加入0.2mL原花青素提取液（避光）, 混匀, 避光反应60min后, 在515nm下测定残留DPPH自由基吸光值, 每个试验平行反复三次。
抑制率: X=（1-[DPPH]t /[DPPH]t=0）×100
式中:
[DPPH]t=0表示0 时刻体系中DPPH·起始浓度;
[DPPH]t表示t 时刻体系中DPPH·浓度。
以各样品浓度对 DPPH清除率作图, 能够得到各样品对D P P H 清除率达 5 0 % 时所需各样品量, 即IC50值。
四、 综合比较,
花青素、 多糖单独存在时IC50以及黑枸杞多糖与花青素复配物IC50得出多糖、 花青素对自由基清除协同作用。
五、 参考文件
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[2]白海娜. 黑木耳多糖AAP-4与原花青素对辐射诱导氧化损伤协同防护作用[D].哈尔滨工业大学,.
[3]余红军,李立祥,倪媛,袁芳,王晓莉,孙海洋.油茶籽壳中多糖和原花青素超声波提取工艺[J].食品与发酵工业,,36(08):194-197.
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[5]李春阳,许时婴,王璋.DPPH法测定葡萄籽原花青素清除自由基能力[J].食品与生物技术学报,(02):102-106.