婴幼儿奶粉中双氰胺的检测方法HPLCMSMS法.doc

婴幼儿奶粉中双氰胺检测方法（HPLC-MS/MS法）

北京时间1月25日凌晨消息, 新西兰牛奶中发觉了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺, 缩写DICY或DCD。即使国际标准未对食品中双氰胺限量, 但高剂量双氰胺对人体是有毒。
针对婴幼儿奶粉中基质复杂特点, 本方法加大了净化材料用量, 以取得了愈加好净化效果。采取天津博纳艾杰尔科技新一代Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500mg/15mL, 货号: MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色谱柱, 建立了奶粉中双氰胺MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。

1 试验部分
1.1 仪器、 试剂与材料
高效液相色谱仪, 涡旋振荡器, 超声波清洗机, 氮吹仪。
双氰胺标准品（CAS: 461-58-5; FW=84.08）, 新一代Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管, Venusil® HILIC液相色谱柱, 微孔滤膜, 乙酸铵、 乙酸、 乙腈为色谱纯, 试验用水为超纯水。

表1 双氰胺信息
名称
结构式
分子量
CAS
双氰胺

84.08
461-58-5

1.2 试验步骤
称取1g试样于50mL具塞离心管中, 加2mL水, 涡旋30s, 加2ml乙腈涡旋30s。再往现有提取液中加2mL乙腈, 反复上述提取步骤。再将该提取步骤反复2次, 得到累计约10mL提取液。以4000r/min离心5min, 将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL）, 将MAS管上下晃动30s, 然后涡旋30s后, 8000r/min离心5min, 取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中, 50℃下氮气吹干, 加入1ml乙腈复溶, 过0.22μm微孔滤膜, 待测。
注: 1.做基质加标试验时标准溶液提议选择以水为溶剂, 预防加标瞬间发生蛋白沉淀;
2.乙腈提取分4次, 为预防乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快, 影响提取效果。

1.3　试验条件
1.3.1 LC-MS/MS法:
（1）色谱条件:
色谱柱: Venusil® HILIC（ 5μm, 100Å, 2.1*150mm）;
流动相: A: 0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）
B: 乙腈;
进样量: 10µL; 柱温: 30℃; 流速: 0.3 mL/min。
表2 流动相梯度程序
时间, min
A%
B%
0
10
90
0.4
50
50
1.8
50
50
1.9
10
90
7
10
90

*备注: 本文曾尝试过多个C18色谱柱, 对双氰胺没有保留, 需要使用离子对试剂, 不过无法用于LC-MS/MS; 也曾尝试过MERCK ZIC-HILIC柱, 不过得到双氰胺峰面积偏差较大, 分析原因是其含有阳离子交换基团, 对双氰胺有不稳定死吸附。最终确定使用键合丙基酰胺Venusil HILIC柱, 以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。

（2）质谱条件:
质谱仪: API 4000+; 离子源: 电喷雾离子源; 扫描方法: 正离子扫描; 检测方法: 多反应监测; CAD: 8.00; CUR: 20.00; GS1: 60.00; GS2: 50.00; IS: 5500.00; TEM: 600.00。
表3双氰胺质谱信息
药品名称
监测离子对
DP

EP
CE
CXP
双氰胺
85.1/68.1
71
10
41
6

85.1/43.1
71
10
41
6
注: 带“____”监测离子对为定量离子对。
2 结果与讨论
2.1 LC-MS/MS法
2.1.1双氰胺LC-MS/MS图

图4 双氰胺10ng/ml标准溶液质谱图
2.1.2实际样品基质加标线性关系和检出限
正确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中, 加水溶液并稀释至刻度, 作为标准贮备液;
分别称取1g奶粉试样, 添加一定量标准溶液, 配制成含双氰胺为5ng/mL, 10ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL和200ng/mL添加样品, 根据上述提取、 净化方法操作, 所得净化液根据上述液质条件, 依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 拟合线性方程, 结果见表6:
表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）
名称
保留时间
线性方程
相关系数
最低定量限（S/N=10）
双氰胺
2.25min
Y=3859.1X+23694
0.9900
2ng/g
2.1.3正确度和精密度
选择市售某婴幼儿奶粉试样, 进行添加回收试验, 结果见表7。采取空白样品稀释法判定检测方法基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释标准溶液, 双氰胺峰面积和相对丰度比无显著改变, 故判定该方法无基质效应影响。
表7 10ng/g添加回收试验结果
平行1
平行2
平行3
平均值
RSD
82.5%
83.5%
89.3%
85.2%
4.31%

图 5 婴幼儿奶粉空白质谱图 图 6 婴幼儿奶粉10ng/g添加水平质谱图

3 产品订货信息

产品名称
规格型号
货号
新一代
MAS-QuChERS-双氰胺净化管（填料量加大, 更适合婴幼儿奶粉等复杂样品）
500mg/15mL, 50支/包
MS-SQA02
MAS-QuChERS-双氰胺净化管
100mg/2mL, 50支/包
MS-SQA01
Venusil HILIC液相色谱柱
4.6*250mm, 5μm, 100Å
VH952505-0
2.1*150mm, 5μm, 100Å
VH951502-0
微孔滤膜
0.22μm, 直径13mm, 200/Pk
AM021320
双氰胺对照品
500mg /瓶, 含量≥99.0%
DCD-0001
1g /瓶, 含量≥99.0%
DCD-0002
离心管
50mL, 带螺纹盖, 25个/包
LXG0050
一次性注射器
5mL,100/pk
 ZSQ-5ML

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