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微生物限度检查方法适用性试验方案

验证方案组织与实施
微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门有关人员组成验证小组，参与实施。

方案起草
部门/职务
签 名
日 期
质量管理部QC

方案审核
部门/职务
签 名
日 期
质量管理部QC经理

方案批准
部门/职务
批 准 人
批 准 日 期
质量管理部质量总监

目 录
一、 概述
二、 验证目的和风险评估
三、 验证内容
四、方法判定
五、再验证周期
六、参考文献
七、结果评价及结论

1、概述：
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。
由于依照中国药典2010版的检查方法验证,需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌均采用平皿法。故现升级为中国药典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。
2、试验目的和风险评估：
验证目的：确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。
风险评估：
项目
潜在失效模式
失效影响
采取措施
未按方案执行
试验部分项目出现偏差和漂移
直接影响试验结果的
正确性
严格执行经批准
的试验方案
试验过程操作不当
未达到试验标准
试验失败
未严格遵循试验方案规定
3、验证内容：
3.1、培养基来源：
品名
批号
规格
来源
胰酪大豆胨琼脂培养基

微生物限度检查用
中检所
沙氏葡萄糖琼脂培养基

微生物限度检查用
中检所
胰酪大豆胨液体培养基

无菌检查和微生物限度检查用
中检所
沙氏葡萄糖液体培养基

微生物限度检查用
中检所
麦康凯琼脂培养基

微生物限度检查用
中检所
麦康凯液体培养基

微生物限度检查用
中检所
确认人： 确认日期：
3.2、检查用培养基配制方法：
培养基名称
配制方法
PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
取本品14.63g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。
胰酪大豆胨琼脂培养基
取本品40g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。
沙氏葡萄糖琼脂培养基
取本品65.0g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。
胰酪大豆胨液体培养基
取本品29.8g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。
沙氏葡萄糖液体培养基
取本品30.0g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。
麦康凯琼脂培养基
取本品50.0g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。
麦康凯液体培养基
取本品35.0，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。
确认人： 确认日期：
3.3、使用仪器
名称
型号
校验单位
有效期至
生化培养箱

生化培养箱

生化培养箱

确认人: 确认日期：
3.4、验证试验用菌种：
菌种名称
代号
传代代数
来源
金黄色葡萄球菌
CMCC（B）26003

中检所
大肠埃希菌
CMCC（B）44102

中检所
铜绿假单胞菌
CMCC（B）10104

中检所
枯草芽孢杆菌
CMCC（B）63501

中检所
白色念珠菌
CMCC（F）98001

中检所
黑曲霉菌
CMCC（F）98003

中检所
确认人： 确认日期：
3.5试验方法：
取供试品 10 g加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。
3.6菌液的制备：
3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～ 35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7， 分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。
3.6.2取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入沙氏葡萄糖液体培养基中置20～25℃培养箱中培养24～48h，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。
3.6.3取黑曲霉的新鲜培养物接种子沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。取1ml加入含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，取，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。
3.7需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验：
3.7.1供试液制备：
取供试品10 g（ml或cm2），加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。
3.7.2实验条件：
需氧菌培养温度：30～35℃ 3～5天 培养箱：
霉菌和酵母菌培养温度：20～25℃ 5～7天 培养箱：
3.7.3试验方法：
3.7.3.1试验组：
3.7.3.1.1分别取供试液9.9ml，分别加入0.1ml浓度为1000CFU的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，混匀后取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过3天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。
3.7.3.1.2分别取供试液9.9ml，分别加入0.1ml浓度为1000CFU白色念珠菌、黑曲霉菌液，混匀后分别取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。另分别取其中1ml注皿, 倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，置20～25℃或培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。
3.7.3.2菌液对照组：分别取稀释液9.9ml，分别加入0.1ml浓度为1000CFU的菌液，按试验组操作,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，置与试验组相同条件下培养, 计数。每株试验菌平行制备2个平皿。
3.7.3.3供试品对照组：取供试液1ml，倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，置与试验组相同条件下培养, 计数。每株试验菌平行制备2个平皿。
3.7.4 实验结果
3.7.4.1结果判定：试验组的菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
比值=试验组菌落数～供试品对照组的菌落数*
对照组菌落数
3.7.4.2需氧菌计数方法适用性试验结果
试验次数：1 供试品批号:
菌种类型
试验组
菌液组
供试品
对照组
比值
铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

检验人： 日期：
复核人： 日期：
试验次数：2 供试品批号:
菌种类型
试验组
菌液组
供试品
对照组
比值
铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

检验人： 日期：
复核人： 日期：
试验次数：3 供试品批号:
菌种类型
试验组
菌液组
供试品
对照组
比值
铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

检验人： 日期：
复核人： 日期：
3.7.4.3霉菌和酵母菌计数方法适用性试验结果
试验次数：1 供试品批号:
菌种类型
试验组
菌液组
供试品
对照组
比值
白色念珠菌

黑曲霉

检验人： 日期：
复核人： 日期：
试验次数：2 供试品批号:
菌种类型
试验组
菌液组
供试品
对照组
比值
白色念珠菌

黑曲霉

检验人： 日期：
复核人： 日期
试验次数：3 供试品批号:
菌种类型
试验组
菌液组
供试品
对照组
比值
白色念珠菌

黑曲霉

检验人： 日期：
复核人： 日期
3.7.5结论:

检验人： 日期：
复核人： 日期：
3.8控制菌微生物检测方法适用性试验：
3.8.1实验方法：
3.8.1.1试验组：取供试液10ml及不大于100cfu大肠埃希菌菌液加入胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18-24小时, 取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24-48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30～35℃培养18-72小时。试验组应生长良好。
3.8.1.2阴性对照组： 取稀释剂10ml,加入胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18-24小时，阴性对照应无菌生长。
3.8.1.3阳性对照组：取不大于100cfu大肠埃希菌菌液加入胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18-24小时, 取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24-48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30～35℃培养18-72小时。阳性对照组应生长良好。
3.8.2 实验结果：
试验次数：1 供试品批号:
控制菌
项目
常规法
大肠埃希菌
试验组

阳性对照组

阴性对照组

检验人： 日期：
复核人： 日期：

试验次数：2 供试品批号:
控制菌
项目
常规法
大肠埃希菌

试验组

阳性对照组

阴性对照组

检验人： 日期：
复核人： 日期：
试验次数：3 供试品批号:
控制菌
项目
常规法
大肠埃希菌
试验组

阳性对照组

阴性对照组

3.8.3结论：

检验人： 日期：
复核人： 日期：
4. 方法判定：
本品按《中国药典》2015年版（1105）、（1106）非无菌产品微生物限度检查项下：“微生物计数法”“控制菌检测法”进行试验。
细菌数测定可用 。
霉菌、酵母菌数测定可用 　。
控制菌 ，
可用 　 。
5、再验证周期：
当产品的微生物限度检查方法改变、产品组分、工艺改变时，应进行再试验。
6、参考文献：
中国药典2015版
7． 结果评价及结论：
验证标准，该适用性试验方法 接受 。
审核人/日期：
批准人/日期：
10