微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法.docx

微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法

姓名

摘要：纯培养技术是进行微生物学研究的基础。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。本实验通过稀释涂布平板法和平板划线分离法分离纯化微生物以获得纯培养并进行平板菌落计数，旨在了解微生物的纯培养含义和意义、熟练掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术、了解利用平板菌落计数法测定微生物样品中活细胞的原理、学习平板菌落计数的操作步骤与方法。实验结果表明，本实验达到了预期的目的。
关键词：微生物的纯培养、微生物的分离与纯化、平板菌落计数法

1.引言
自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。只有纯培养物才能提供可以重复的有意义的结果，纯培养技术是进行微生物学研究的基础。形状稳定的纯培养（菌种）是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。常用的方法有：
（1）简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。
（2）平板分离法：微生物的平板分离纯化技术自1880年Koch发明以来已有100多年的历史。该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动植物细胞培养等方面的应用作出了巨大贡献。由此可见，一项新的重大的微生物学实验技术的建立会对整个生命科学带来革命性的变化。随着分子生物学的发展和学科的相互渗透，微生物的分离鉴定技术将获得新的突破。目前发展的PCR、16S rRNA探针杂交技术、荧光抗体技术等已开始用于自然环境中某些特殊微生物的分离、鉴定，特别是对那些现在认为是非可培养的微生物。平板分离纯化技术的基本原理包括两方面：第一，选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。第二，微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，适用于细菌、酵母等单细胞微生物以及放线菌和霉菌的孢子，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，我们常用菌落形成单位CFU来表示，由此得到的计数结果的单位是CFU/mL，而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。
2.材料和方法
2.1 材料和试剂
实验菌种：大肠杆菌
实验培养基：150mL LB固体培养基
实验仪器：无菌玻璃涂棒、5支1mL无菌吸管、接种环、10套无菌培养皿、5支盛有4.5mL无菌水的试管、试管架、恒温培养箱、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、火柴
2.2 方法
2.2.1稀释涂布平板法
（1）倒平板。将150mL LB固体培养基用灭菌锅加热融化溶解保温，温度100℃，时间30min），之后冷却至55～60℃（不烫手为宜）。冷却后分别给6套无菌培养皿倒平板。倒平板的方法是：右手持盛LB培养基的三角瓶置酒精灯火焰旁边，用左手将试管塞轻轻地拔出，试管口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住试管塞。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15 mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上10分钟以上，待凝后即为平板。将平板标记分配（10-3、10-4、10-5的稀释度各两套培养皿）。
（2）系列稀释。取5支盛有4.5mL无菌水的试管，依次标记10-1、10-2、10-3、10-410-5。用1mL无菌吸管吸取0.5mL已充分混匀的大肠杆菌菌液（待测样品）至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-1的试管振荡使菌液充分混匀。另取一支1mL无菌吸管插入10-1的试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。用此吸管吸取10-1已充分混匀的菌液0.5mL于10-2的试管中，此即为100倍稀释。该支无菌吸管放回封套中，并对应着10-1试管。依次类推，直至最后用吸管吸取10-4菌液0.5mL已充分混匀的菌液于10-5的试管中，此即为105倍稀释。
（3）涂布。取6套LB培养基已经凝固的无菌培养皿，分别用记号笔标明10-3、10-4、10-5稀释度，每个稀释度各2套无菌培养皿），用刚才分别与10-3、10-4、10-5的试管对应的无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管稀释菌悬液中各吸取0.2mL，对号放入已写好稀释度的平板中。用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，将培养皿平放于实验台上室温下静置10～15min，使菌液渗入培养基表层内。平板涂布方法：将0.2 mL菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置（0.2mL的菌液要全部滴在培养基上，若吸管尖端有剩余的菌液，需将吸管在培养基表面上轻轻地按一下便可）。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。
（4）培养。将LB培养基平板倒置于37℃温室中培养24～48h。
（5）计数、计算。培养48h后，取出培养皿，首先确定培养皿合适的稀释倍数D（-3、-4、-5），然后统计出某个稀释度下几个平板菌数的平均值X，依据平板上加入菌液量Y mL，得到样品中菌数（CFU/mL）＝(X×D)/Y。
（6）挑取单菌落。将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，置于37℃的温箱培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离及培养，直至确证纯培养。最后选择合适的方法保存菌种。
2.2.2平板划线分离法
（1）倒平板。按稀释涂布平板法倒平板，得到3套LB固体培养基。
（2）划线。在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌菌液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。我们使用四分区划线法，其接种步骤是：用接种环以无菌操作挑取大肠杆菌菌液一环，先在平板培养基的一边作第一次平板划线3～4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分做第三次划线和通过第三次平行划线部分做第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
（3）挑取单菌落。同稀释涂布平板法，进一步划线分离及培养，检测菌落纯度，确证纯培养，选择合适的方法保存菌种。
2.2.3 阴性对照组
取一个150mL LB固体培养基作为阴性对照组，不接种大肠杆菌菌悬液，培养方式等其他因素不变。
3.结果

图1、图2：用稀释涂布平板法得到的10-3稀释度的两个大肠杆菌培养基
图3、图4：用稀释涂布平板法得到的10-4稀释度的两个大肠杆菌培养基
图5、图6：用稀释涂布平板法得到的10-5稀释度的两个大肠杆菌培养基
图7、图8、图9：用平板划线分离法得到的大肠杆菌培养基
图10：阴性对照组，没有接种大肠杆菌的LB固体培养基

（1）用稀释涂布平板法系列稀释后可以得到单菌落（图5、图6），培养基涂布均匀，大肠杆菌菌落呈针尖状，达到分离纯化的目的，可以获得纯培养。
（2）用平板划线分离法得到的三个培养基（图7、图8、图9）均有单菌落，培养基涂布均匀，大肠杆菌菌落呈针尖状，达到分离纯化的目的，可以获得纯培养。
（3）用稀释涂布平板法得到的10-5稀释度的两个大肠杆菌菌落培养基中，菌落数分别是840和895。由此计算得到样品中菌数（CFU/mL）＝（867.5×0.2）／10-5＝1.735×107。
4.讨论
（1）用1mL无菌吸管吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。
（2）吸管尖在向盛有无菌水的试管里放菌液的时候不要碰到液面，而且每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液。否则稀释不精确，结果误差较大。
（3）涂布平板用的菌液量一般以0.2mL较为适宜。如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。
（4）稀释涂布平板法中利用试管稀释的菌液一定要摇匀使细胞分散。
（5）培养皿一般皿底标记，标记要简单明了。需要标明操作者和组员、浓度、时间、菌样、添加物等。
（6）用无菌玻璃涂棒涂布培养基的顺序是由低浓度向高浓度，即先涂布10-5稀释度的培养基，再先涂布10-4稀释度的培养基，最后涂布10-3稀释度的培养基。
（7）一般选择每个平板上长有30～300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的重复对照的菌落数不应相差很大，否则实验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-3、10-4、10-5三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。
（8）实验结束后要及时清洗培养皿，把废弃培养基扔到垃圾袋里。

参考文献
［1］ 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验.北京：高等教育出版社，1999年.
［2］ 周长林.生物学实验与指导. 北京：中国医药科技出版社，2004年.
［3］ 徐威.微生物学实验（第二版）. 北京：中国医药科技出版社，2014年.
［4］ 汪天虹.分子生物学实验. 北京：北京大学出版社，2009年.