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观察四君子汤四种制备方法疗效的进一步实验

[摘要]目的：比较合煎、单煎、粗颗粒煎煮、超细粉末四种不同方法制备的四君子汤对小白鼠的“脾虚”模型的治疗效果，探讨不同制备方法所得的四君子汤汤剂的疗效差异。方法：给实验小鼠注射利血平造成脾虚模型，测定服用不同方法制备四君子汤制剂的小鼠血清木糖含量及溶血空斑计数，并检测四种四君子汤供试品中总多糖的含量。超细粉末、粗颗粒煎煮组给药量为原处方量的一半。结果：血清木糖含量测定结果表明，与脾虚组相比，四君子汤合煎组疗效显著（t检验，p＜0.01）；超细粉末组（1/2剂量）组也有一定改善，但没有显著性差异。溶血空斑计数结果表明，与脾虚组相比，四个给药组均有显著疗效（t检验，p＜0.01），疗效顺序为合煎＞超细粉末＞单煎＞粗颗粒。合煎剂中多糖含量最高，与药效学实验结果相符，进一说明多糖类成分是四君子汤发挥疗效的有效成分之一。结论：本实验条件下，四君子汤合煎疗效好于单煎，提示四君子汤合煎有利于有效成分的溶出。超细粉末、粗颗粒组在给药量减半的情况下也能取得较好的药效，提示这两种给药方法能够减少用药量、降低治疗成本。四君子汤疗效和化学成分的关系还需进一步深入研究。
[关键词]四君子汤；合煎；超细粉末；脾虚；免疫功能；多糖比色法；血清木糖

中药的剂型的选择是值得每一个中医药工作者深思的问题。自古以来，我们祖先就在中药剂型的研究道路上发展出了丸、煎、散等多种剂型。但是中药新剂型能否取得和传统煎剂的同样疗效，值得进一步研究。
目前，中药汤剂大致有两种模式：一种是根据医生处方，用水合煎炮制的中药饮片，供患者饮用。该方式有着悠久的历史，是临床上常用的给药方式。另一种是根据医生处方将单味中药水煎提取的浓缩配方颗粒用水化饮用。此模式流行的时间相对较短，我们称之为“新型汤剂”。先是在日本，韩国和我国台湾省，近些年来内地对此也加以重视，已经有很多种配方颗粒供医院使用。
“新型汤剂”在使用配方颗粒没有合煎过程是否会影响疗效？对于这种合煎与单煎的差异性问题正在展开大量的研究。许多实验结果表明：新型汤剂与传统汤剂的效果相当的占大部分，效果更好的或较差的占小部分。[1]
中药煮散系指将药材的粗颗粒与水共煮，再去渣取汁而制成的液体制剂。与传统汤剂相比，药材的表面积增大，煎煮效率大大提高，制备时间缩短，还有利于节省药材和提高疗效。
随着科学技术的发展，纳米技术被广泛应用。中药纳米技术是以剪切力为主要力学特征的超微粉碎技术。应用超微粉碎技术加工中药材的目的是将动植物的纤维细胞壁打碎，达到细胞及亚细胞水平，细胞内有效成分、化合物显露出来，充分发挥其药物活性[2]。
四君子汤出自宋代的《圣济总录》由人参，白术，茯苓，甘草组成。具有健脾益气的功效，主要治疗脾气虚弱的病症。现今临床多用党参代替人参，即党参方，该方是为当今中医临床的基本方，经典方，临床上一般合煎饮用。具有肯定的疗效，相对简单的组成，但是关于其不同制备方法疗效比较的文章却是少见。
本实验选用不同制备方法的四君子汤对脾虚模型的治疗作用来比较中药制备方法与疗效的关系。2000级学长在参加本课程时，曾探讨了四君子汤单煎与合煎对疗效的影响，得到了一些实验结果。对此问题我们仍有兴趣，应用利血平造成的脾虚小鼠模型，进一步比较四君子汤单煎与合煎的疗效差异，讨论“新型汤剂”的合理性。此外，我们比较超细粉末入药以及粗颗粒煮散这两种药物制备方法对疗效的影响，为临床合理用药提供参考。

主要研究内容：
比较四君子汤合煎剂、单煎剂合并的药效;
比较四君子汤超细粉末与常规饮片煎煮后的药效;
比较四君子汤粗颗粒煎煮制剂和常饮片单煎剂合并的药效;
比较四君子汤粗颗粒煎煮制剂和超细粉末的药效;
比较不同中药制备方法的效果与多糖类有效成分的关系。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂
党参、茯苓、白术、甘草，购自老城隍庙童涵春中医门诊部。
利血平：上海复旦复华药业有限公司 批号991005。
邻甲苯胺试剂：邻甲苯胺8ml，硫脲0.15g，冰乙酸95ml。溶解混匀，密封保藏于棕色试剂瓶内。
硫酸蒽酮：0.2g加98％搅匀备用。
绵羊红细胞悬液：10％的小牛血清－RPMI1640液，新鲜豚鼠血清1：10。
D－木糖：上海兰季科技发展有限公司，批号070301。
25％苯甲酸；10%钨酸钠；都氏试剂；等。

1.2仪器与设备
uv7504紫外分光光度计 上海欣茂仪器有限公司
722N 分光光度计 上海精密科学仪器有限公司
贝利微粉机 济南倍力粉技术工程有限公司 
37度温箱、注射器、长针、离心机、离心管、水浴锅、移液器、试管、移液管、洗耳球、布氏漏斗等

1.3 动物分组及用药：
体重20克左右雄性小鼠60只，随机分成六组：正常对照组、脾虚模型组、合煎剂治疗组、单煎合并剂治疗组、粗颗粒煮散治疗组（1/2剂量）、超细粉末治疗组（1/2剂量）。各治疗组先在造模前常规饲养2天，每天灌服中药制剂0.4ml/只，对照组喂服等体积饮用水。除正常组外，各组小鼠肌肉注射利血平进行脾虚造模，持续七天，第七天处死小鼠，取血2ml，测定血清中木糖及溶血素含量。
采用人类同等体重的10倍量给药。

1.4 动物模型：
采用由利血平造成的脾虚大鼠模型。利血平的剂量：每只小鼠给药按照0.3 mg/ (kg·d)的药量肌注给药，连续给药7天。[3]

1.5 药物制备方法：
参照方剂学（人民卫生出版社）02年9月1版中四君子汤（党参方）[4]，具体为：党参：茯苓：白术：甘草=9：9：9：6。
合煎剂：党参、茯苓、白术、甘草按照9:9:9:6的比例配成，按照传统方法先将中药材用冷水浸泡，在武火煎煮15分钟后文火30分钟，取出头煎液。再加冷水同上方法煎煮为二煎。两煎液合并浓缩为所需要量，4℃低温保存。

单煎剂：根据上述配方比，将中药方中的每一味药分别煎，然后最后将水溶液合并为最后药液，4℃低温保存。

粗颗粒煮散：将各味药材粉碎成2mm左右的粗颗粒。按处方量混合均匀，先浸泡2小时后煎煮半小时，纱布滤出药液，再加水煎煮半小时，合并两次药液，浓缩成所需要量，4℃低温保存。用药量为正常用量的1/2。

超细粉末：药材按处方量混合，用倍力超下超微粉碎机粉碎。药材粉末过九号筛（200目，＜＝75μm，临用前配成混悬液，浸泡过夜，取上清液灌胃，用药量约为正常用量的1/2。4℃低温保存。

1.6检测方法
1.6.1 血清木糖含量测定——参考《中医学综合实验》中有关血清木糖的检测方法[5] 。

蛋白滤液制备
（Ⅰ）取大鼠灌服5%D-木糖溶液0.3g/kg，1h后取血，制备血清；
（Ⅱ）取试管放入血清0.25ml，加蒸馏水2ml，再加0.3ml/L硫酸0.125ml，再加10%钨酸钠0.125ml，均随加随摇。离心沉淀，去蛋白质，即得无蛋白滤液。
取试管按如下操作：

试剂
测定管
标准管
标准管
空白管
无蛋白滤液（ml）
1.0

D-木糖标准液
2.0
1.0

蒸馏水
1.0
1.0

2.0

邻-甲苯胺试剂（ml）
5.0
5.0
5.0
5.0

混匀，置沸水浴中煮8min，流水冲冷1~3min（空白管放室温,不煮）；
调分光光度计成470nm，以空白管对零点，测定各管A值。
先求标准管A的平均值K：
K（mg/ml）=（标准管1A值/0.1+标准管2A值/0.05）/2
然后算出血清中木糖含量：
血清中木糖量（mg/ml）=测定观光密度 / K ╳ 10

1.6.2 血清中溶血素含量的测定——参考《免疫学技术的原理和方法》中有关的实验部分[6]
(I) 给药
各组小鼠，于造模第二天腹腔注射羊红细胞悬液0.2ml/鼠，在免疫后3日，处死。
(II)绵羊红细胞悬液制备
无菌绵羊血生理盐水洗涤三次，2000转/分钟，每次5分钟，然后配成2×109个/ml和2.5×109个/ml红细胞备用。
（III）免疫动物及脾细胞悬液的制备
2×109个/ml红细胞悬液实验前三天腹腔注射0.2ml，实验当天经颈动脉放血处死，采集血液，摘取脾脏，用10%含小牛血清的rm1640稀释成1×107个/ml脾细胞备用。
（IV）溶血空斑测定：试管内加0.1ml的豚鼠补体和10%的SRBC0.05ml，在加入1×107个/ml脾细胞0.1ml后迅速混合，取0.1ml滴入玻片小室中，37℃温箱两小时后观察结果。

1.6.3 方药有效成分的含量测定——参考《常用中草药有效成分含量测定》中有关中有关猪苓多糖的测定方法。[7]
实验方法：蒽酮-硫酸法，测定波长为625nm。
（I）最大吸收波长的选择
分别吸取经硫酸蒽酮显色后的无水葡萄糖溶液、样品供试液，以加显色剂后的蒸馏水溶液作空白，于500～700nm波长进行扫描。
（II）显色稳定性考察
对照品溶液及样品供试液显色后，冷却30分钟后，通过测定放置不同时间的吸光度。
（III）标准曲线的绘制
精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖80.0mg，用蒸馏水溶解并定容100ml，再稀释10倍，配成0.08mg/ml的标准品溶液。精密吸取0.5ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml、2.0ml的标准品溶液，分别置干燥试管中，补加蒸馏水至2.0ml，摇匀，加0.2%硫酸蒽酮4.0ml，迅速摇匀。45分钟后，以蒸馏水2.0ml加显色剂4.0ml为空白，分别于625nm处测定。以吸光度Y为纵坐标，浓度为横坐标X（mg/ml），绘制标准曲线。
（IV）样品含量测定
取四种不同方法制备的四君子汤水溶液，用95%乙醇醇沉至含醇量80%。取沉淀（多糖），用蒸馏水定容至100ml，稀释250倍，作为供试品溶液。取供试品溶液各取2.0ml，加0.2%硫酸蒽酮4.0ml，迅速摇匀。45分钟后，以蒸馏水2.0ml加显色剂4.0ml为空白，分别于625nm处测定吸光度计算多糖含量。
1.7 统计与处理
本实验所得结果以平均值±SD表示，使用EXCEL软件的分析工具库进行数据的方差分析与t检验。

3 实验结果
3.1 动物造模的情况
造模后的四天开始，经过利血平注射的实验小鼠均出现体重减轻，精神倦怠，自主活动减少等症状。与文献报道一致，提示造模成功。

3.2 血清木糖含量测定

表1 不同制备方法四君子汤对脾虚模型小鼠血清木糖的影响
均数±标准差
组别
n
血清木糖(mg/ml)
正常对照组
6
0.28±0.07
脾虚模型组
6
0.15±0.07 #
合煎剂治疗组
6
0.26±0.04 *
单煎剂治疗组
6
0.17±0.04
粗颗粒煮散治疗组（1/2剂量）
6
0.15±0.09
超细粉末治疗组（1/2剂量）
6
0.19±0.08
注：#与正常对照组相比P＜0.01，*与脾虚模型组相比P＜0.01

图1 不同制备方法四君子汤对脾虚模型小鼠血清木糖的影响（n=6）
注：#与正常对照组相比P＜0.01，*与脾虚模型组相比P＜0.01

3.3 血清中溶血素含量的测定：

表2不同制备方法四君子汤对脾虚模型小鼠溶血空斑计数的影响
均数±标准差
组别
n
溶血空斑（个/cm2）
正常对照组
6
16.92±5.56
脾虚模型组
6
4.61±1.87 #
合煎剂治疗组
6
16.39±3.00 *
单煎剂治疗组
6
12.84±4.39 *
粗颗粒煮散治疗组（1/2剂量）
6
12.11±3.86 *
超细粉末治疗组（1/2剂量）
6
13.17±2.88 *
注：#与正常对照组相比P＜0.001，*与脾虚模型组相比P＜0.001

图2 不同制备方法四君子汤对脾虚模型小鼠溶血空斑计数的影响
n=6
注：#与正常对照组相比P＜0.001，*与脾虚模型组相比P＜0.001

3.4 方药有效成分的含量测定

（1）最大吸收波长的选择
结果表明，对照品溶液及样品供试液均在625±1nm波长具有最大吸收。

（2）显色稳定性考察
结果表明，对照品溶液及样品供试液吸光度均在30～100分钟内保持稳定。

（3）标准曲线的绘制
标准曲线回归方程为 y = 6.5867x - 0.0003，R2 = 0.9978
多糖在0.02～0.08mg/ml范围内线性关系良好。

（4）样品含量测定
四种不同方法制备的四君子汤水溶液中多糖含量如下

表3 不同制备方法四君子汤样品中多糖含量
制备方法
样品中多糖含量
（mg/g生药）
合煎剂
46.89
单煎剂
26.79
粗颗粒煮散
24.71
超细粉末
23.05

图3 不同制备方法四君子汤单位重量中多糖含量比较

4.讨论

调查表明，传统汤剂的使用率在明显下降。与中成药相比从原来的7：3下降至现在的3：7。其中的原因是多方面的：传统汤剂虽然符合了中医辨证论治的特点，但是煎煮繁琐，服用不便，即使是笃信中医的病人迫不得已时也不敢问津汤剂，多使用中成药或西药祛除病痛；其次是自新中国建立以来，中药新剂型的发展速度很快，已从传统的四大剂型发展到43种剂型，服用方便，疗效肯定。
中药浓缩配方颗粒有明确的质量控制标准，便于运输、贮存、服用方便，得到了患者和医院的欢迎，需求量越来越大，并且远销海外。虽然价格上略高于传统饮片，但是却低于中成药并且可灵活组方运用，符合中医辨证施治的经典理论。
目前认为中药汤剂合煎过程可能发生以下作用：发生增溶助溶作用，提高有效成分的溶出率、发生拮抗作用，降低有毒成分的溶出率、生成新的有效成分或令某些成分发生转化，提高疗效[1]。
本实验选用不同制备方法四君子汤对脾虚模型的治疗作用比较来探讨中药制备方法与疗效的相互关系。

4.1 关于脾虚模型
脾胃学说是祖国医学体系的重要组成部分。“主运化”是脾的最基本生理功能，是脾胃理论的基础，主要包括食物的消化吸收代谢，与消化系统的功能极为密切。脾虚时的消化系统处于紊乱状态，同时脾虚时的机体卫外防御功能也不固,成为隐患多种疾病的基础，而这里的防御功能，相当于现代医学的免疫功能。
利血平是一种公认的脾虚模型的造模药物，其主要机理在于利血平消耗儿茶酚胺类物质，产生交感样作用，从而产生类似脾虚证样表现，该模型的特点是原因明确，条件易于控制，脾虚症状表现明显。通过查阅文献我们可以看到利血平相对于其他药物或方法（大黄、破气耗气、限量营养、劳倦过度）来说，在胸腺湿重和指数，胸腺皮质和厚度，脾脏中央动脉周围淋巴鞘直径，脾脏T淋巴细胞的增值功能，脾脏NK细胞的YAC21肿瘤细胞杀伤率，脾脏巨噬细胞中性吞噬活性等指标上都和其他组别有较好的相似性[8]。因此本实验选用注射利血平的方法复制小鼠脾虚模型。
本次实验中，凡是注射利血平的小鼠都在不同程度上，有毛色暗淡、精神倦怠、自主活动减少等现象，溶血空斑实验证明其免疫功能大大低于正常对照的空白组，血清木糖含量也较低，与文献报道一致，提示造模是成功的。
机体口服D-木糖后一定时间内血和尿中D一木糖含量基本上可反映小肠吸收功能状况。本实验观察到脾虚大鼠血清D-木糖值显著降低，说明脾虚时小肠吸收功能低下，其原因之一为小肠、结肠运动频率变快：其二是消化道存在不同程度功能紊乱，消化酶分泌减少，活性降低[9]。

4.2 四君子汤四种制备方法对脾虚模型小鼠的作用

实验结果显示：四君子汤合煎防治组所检测指标的改善作用比较明显，其木糖吸收率和溶血空斑试验都比脾虚模型组有明显改善，治疗结果已经接近了正常对照组，且以上两项指标都处于四个治疗组的第一，说明了四君子汤合煎液对脾虚模型的免疫功能及消化功能的改善优于中药的其它制备方法。单煎防治组的两个观察指标结果相对较差。
服用四君子汤超细粉末的小鼠其木糖吸收率与脾虚模型组有提高趋势，但没有统计学差异；而在免疫功能方面却有明显的差异。需要指出的是，相当于1/2生药量的超细粉末组有改善免疫指标的作用，这提示我们超微粉末在提高疗效上有着自己独到的疗效。文献显示超微粉末有以下优点：（1）表面积增加、空隙率增大、增大了胃肠道接触面积，加大胃肠对有效成分的吸收；（2）超微细粉在低温条件下进行，能够保存药材应该有的有效成分不被破坏，提高药效；（3）避免药物受热、煎煮后有效成分的损失，最大限度的利用资源[10] 。本实验的部分结果支持此观点，我们认为中药超微粉末是一种值得深入研究的中药制剂方法。
实验中也观察到，在给药量减半的情况下，粗颗粒煮散组对免疫指标也有改善的作用，提示这种给药方法能够减少用药量、降低治疗成本，也具有一定的合理性和实际应用价值。

4.3四种制备方法的四君子汤多糖类有效成份的影响

多糖是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是构成生命的分子基础之一。自20世纪60年代以来，人们陆续发现多糖具有更多的药理作用，不仅可以作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，还可以在抗肿瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、抗辐射等方面具有广泛的药理作用。近年来，多糖成为天然药物研究的一个热点。
四君子汤党参、茯苓、白术、甘草均含有较多的多糖类成分，是四君子汤发挥免疫调节作用的物质基础之一[10-14]。本文初步比较了四种制备方法对多糖类含量的影响，实验结果表明：⑴ 四君子汤合煎剂的多糖提取率高于单煎，说明在汤剂中其他成分相互作用下，有助于多糖类成分的溶出，这在一定程度上也说明了中药复方汤剂合煎的合理性的科学性。⑵ 超细粉末组多糖的含量与粗颗粒煎煮组含量接近，但超细粉末组样品是用浸泡法制备的，临床用药时更为方便，是一种值得尝试的药物制备方法。⑶ 合煎剂中多糖含量最高与药效学实验结果相符，进一说明多糖类成分是四君子汤发挥疗效的有效成分之一。
本文初步比较了四种制备方法对多糖类成分的影响。制备方法对于处方中其他有效物质影响，还需做进一步比较研究。
感谢：本实验操作中，得到教学实验中心韩志芬老师、于丽华老师和侯剑伟老师的细心指导，得到动物实验中心老师的大力帮助，我们的实验结果，与他们的帮助分不开，在此表示深深的谢意！
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