雌激素对体外骨髓间充质干细胞成骨及成纤维相关基因的影响.doc

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彭伟，等. 雌激素对体外骨髓间充质干细胞成骨及成纤维相关基因的影响

雌激素对体外骨髓间充质干细胞成骨及成纤维相关基因的影响

彭 伟1，秦 媛2，李坤河3，陈松龄4(1中山大学附属第一医院口腔正畸科，广东省广州市 510080；2解放军第四军医大学附属口腔医院急诊与综合临床科，陕西省西安市 710000；中山大学附属第一医院，3麻醉科，4口腔颌面外科，广东省广州市 510080)

引用本文：彭伟，秦媛，李坤河，陈松龄. 雌激素对体外骨髓间充质干细胞成骨及成纤维相关基因的影响[J].中国组织工程研究，2016，20(33):48694875.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.33.001 ORCID: 0000-0002-2899-5703(陈松龄)

文章快速阅读：
雌激素对骨髓间充质干细胞成骨及成纤维相关因子碱性磷酸酶、Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的影响

彭伟，男，1984年生，江西省人，汉族，2011年中山大学毕业，硕士，医师，主要从事口腔临床工作。

通讯作者：陈松龄，博士，教授，中山大学附属第一医院口腔颌面外科，广东省广州市 510080

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:2095-4344
(2016)33-04869-07
稿件接受：2016-05-20

抽取髂骨骨髓培养骨髓间充质干细胞

实时PCR证实：
雌激素可以增加Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA的表达而雌激素对碱性磷酸酶基因的表达没有影响
培养基中加入10-7mol/L的雌激素
采用密度梯度离心法分离比格犬骨髓干细胞，反复贴壁法纯化

文题释义：
雌激素：是一种男女均可产生的激素，肾上腺皮质也产生少数雌激素。女性进入青春期后，卵巢开始分泌雌激素，以促进阴道、子宫、输卵管和卵巢本身的发育，同时子宫内膜增厚而产生月经。雌激素还能促使皮下脂肪富集，体态丰满；乳腺增生，乳头、乳晕颜色变深，并产生性欲；促使体内钠和水的潴留，骨中钙的沉积等。男性的睾丸酮激素少部分可转化为雌激素。
Ⅰ型胶原：属于成纤维胶原，含量丰富，存在于多种结缔组织中，它具有多方面的生物活性，不仅是非常重要的组织支持物，而且是细胞外间质的重要成分。研究表明，Ⅰ型胶原生物相容性好，降解速度可调，而且可参与组织修复，是一类优良的可引导组织再生的生物材料。Ⅰ型胶原作为体外细胞培养支架时，有促进细胞黏附和诱导生长分化的作用，是良好的培养黏附剂。另外，它的降解产物还能被细胞利用合成新的基质。

摘要
背景：研究发现骨髓来源的间充质干细胞与牙周膜细胞体外共培养后，可分化为牙周膜纤维细胞。研究提示雌激素具有影响骨髓组织再生的能力。
目的：观察雌激素对骨髓间充质干细胞成骨及成纤维相关因子碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白的影响。
方法：体外培养比格犬骨髓间充质干细胞并鉴定，利用一定浓度雌激素对比格犬骨髓间充质干细胞进行干预，RT-PCR检测成骨、成纤维相关基因的表达变化，Western Blot 检测雌激素对目的基因蛋白表达的影响。
结果与结论：①雌激素可以增加Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达，对于Ⅰ型胶原来说，雌激素的作用更为显著；②雌激素对碱性磷酸酶基因及蛋白的表达没有影响；③目的蛋白的表达变化和基因变化趋势基本一致；④雌激素可以刺激骨髓间充质干细胞向成纤维细胞方向分化，同时对促进牙周膜矿化的基因无刺激作用。
关键词：
组织构建；组织工程；雌激素；骨髓干细胞；碱性磷酸酶；胶原蛋白；国家自然科学基金
主题词：
雌激素；骨髓干细胞；碱性磷酸酶
基金资助：
国家自然科学基金(81371111)；广东省自然科学基金(2014A030313059)

3
P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083@
Effects of estrogen on osteogenesis and fibroblast-related gene expression of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro

Peng Wei1, Qin Yuan2, Li Kun-he3, Chen Song-ling4 (1Department of Orthodontics, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; 2Emergency and Comprehensive Clinical Department, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xi’an 710000, Shaanxi Province, China; 3Department of Anesthesiology, 4Department of Maxillofacial Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China)

Abstract
BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have been shown to be differentiated into periodontal ligament fibroblasts when co-cultured with periodontal ligament cells. Existing studies have shown that estrogen has the ability to influence bone marrow regeneration.
OBJECTIVE: To investigate the effects of estrogen on osteogenesis and fibroblast-related factors alkaline phosphatase, type I and III collagen in bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells isolated from Beagle dogs were treated with estrogen. Osteogenesis and fibroblast-related mRNA and protein expression of bone marrow mesenchymal stem cells was determined by RT-PCR and western blot assay, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: mRNA and protein expression of type I and III collagen in bone marrow mesenchymal stem cells was upregulated following estrogen treatment; especially, in contrast with type III collagen, the changes of type I collagen were more obvious. Estrogen did not influence mRNA and protein expression of alkaline phosphatase. These findings suggest that estrogen promotes the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into fibroblasts, whereas does not impact the genes involved in parodontium mineralization.
Subject headings: Estrogens; Mesenchymal Stem Cells; Alkaline Phosphatase
Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81371111; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China, No. 2014A030313059

Cite this article: Peng W, Qin Y, Li KH, Chen SL. Effects of estrogen on osteogenesis and fibroblast-related gene expression of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(33):4869-4875.

Peng Wei, Master, Physician, Department of Orthodontics, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Corresponding author: Chen Song-ling, M.D., Professor, Department of Maxillofacial Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

4873
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
0 引言 Introduction
牙周膜再生一直以来都是口腔科学中的研究热点，但目前认为，牙周膜的再生非常困难，如果牙周膜受到破坏，很容易失去抗感染以及自我更新和修复的能力。临床上可以看到部分脱位牙病例，因为牙周膜细胞数量和功能的减弱或消失，牙周膜无法再生，虽然根面残余的牙周膜可能暂时幸存，但愈合多半是以固着性粘连完成，牙根会逐渐吸收并被周围骨组织所替代直至丧失。所以牙周膜再生成功的关键是如何保持或重新获得有活性的牙周膜细胞(periodontal ligament cells， PDLCs)[1]。
2004年Kramer等[2]发现，骨髓来源的间充质干细胞与牙周膜细胞体外共培养后，可分化为牙周膜纤维细胞，同时获得后者典型的生物学特性。最近国内学者的研究也发现：牙周膜成纤维细胞通过旁分泌机制可以诱导骨髓间充质干细胞向其分化[3-5]，这也为利用骨髓来源的间充质干细胞修复牙周组织提供了新的理论基础。雌激素主要通过雌激素受体作用于细胞，骨髓来源的间充质干细胞表面具有高亲和力的雌激素受体。用雌激素刺激在体外培养的间充质干细胞后，细胞的骨钙素分泌增多，提示雌激素具有影响骨髓组织再生的能力[69]。雌激素来促进干细胞增殖的同时，对骨髓干细胞成骨及成纤维相关因子是否会产生影响，进一步牙周膜纤维的重建和再生呢？研究用传统的牙周组织工程方法，体外培养骨髓间充质干细胞，加入雌激素进行干预，通过RT-PCR、Western Blot进行检测，初步研究了体外雌激素对促进骨髓间充质干细胞成骨、成纤维相关因子表达的影响，为利用雌激素促进牙周膜再生提供了依据和参考。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞学实验观察。
1.2 时间及地点 实验于2015年1月至2016年1月在中山大学光华口腔医学院省重点实验室完成。
1.3 材料

实验动物：18-24个月龄雄性体健比格犬由简阳达硕动物有限公司提供。
雌激素对体外骨髓间充质干细胞成骨及成纤维相关基因的影响实验
所用主要试剂及仪器：
试剂及仪器
来源
17-β雌二醇、青霉素、链霉素
Sigma公司，美国
α-MEM培养基、胎牛血清
Hyclone，USA
抗狗CD29抗体、抗狗CD34抗体、抗狗CD44抗体、抗狗CD45抗体
BD，USA
琼脂糖
OXOID公司，美国
RT-PCR试剂盒、DNAMarker
TaKaRa公司，中国
水平电泳槽
Bio-rad公司，美国
移液器
EPpendorfAG公司，德国
凝胶成像分析系统
Bio-rda公司，美国
低速离心机 (KDC-1042型)
科大创新有限公司中佳分公司
CO2恒温孵箱(MCO-15AC型)
Sanyo electric，Japan
倒置相差显微镜及照像系统(IX70-S8F2型)
Olympus optical，Japan
全自动定量绘图酶标仪
(Varioskanflash3001-1275)
Thermo，USA

1.4 实验方法
1.4.1 比格犬骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定
原代培养及纯化：全麻下利用骨髓穿刺抽取比格犬髂骨骨髓，采用梯度密度离心法分离Beagle犬骨髓间充质干细胞，镜下观察待原代P0细胞贴壁融合达80%- 90%时，以1∶2的比例传代培养得到第1代(P1)细胞，每隔3 d换液。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，直至贴壁细胞融合，依据前述方法再次传代。
传代培养：待原代P0细胞贴壁融合达80%-90%时(一般需7-10 d)，弃培养基，PBS润洗，加入胰酶消化液37 ℃消化3-5 min，倒置相差显微镜观察大部分细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，加入完全培养基终止消化，以1∶2的比例传代培养得到第1代(P1)细胞，每隔3 d换液。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，直至贴壁细胞融合，依据前述方法再次传代。以此反复贴壁法纯化比格犬骨髓干细胞。用P2-P4细胞进行后续实验。
免疫组织化学鉴定：取第2-4代比格犬骨髓间充质干细胞，制备成细胞浓度为1×107 L-1的细胞悬液，接种入6孔板中，待细胞爬满爬片，取出，用预热的PBS冲洗3遍，乙醇固定，PBS冲洗，体积分数为30%过氧化氢液1份和纯甲醇50份充分混合，室温下将玻片置于其中30 min，蒸馏水冲洗及PBS冲洗，血清封闭15 min，滴加适当比例稀释的带有荧光标记的CD29抗体、CD34抗体、CD44抗体以及CD45抗体，4 ℃过夜，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，DAB显色剂显色。苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固显微镜下观察并照相。以PBS代替一抗或二抗做阴性对照。
1.4.2 RT-PCR检测雌激素对目的基因表达的影响 通过取生长状态良好的第2-4代比格犬骨髓间充质干细胞，将细胞浓度调整为1×107 L-1，接种于含体积分数10%胎牛血清培养液的细胞培养瓶中培养24 h后，选择生长良好，数量接近的细胞，PBS冲洗，弃去原来的培养基。将细胞分为2组，即空白对照组(培养基中不加任何刺激因子)、雌激素组(培养基中加入10-7 mol/L的雌激素)，培养5 d后，提取细胞的总RNA，反转录为cDNA，然后进行实时定量PCR反应，检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白基因表达的差异。
检测步骤：①收样：PBS洗涤细胞，每孔加入1.5 mL Trizol，冰上匀浆后转移至2 mL RNase-free的EP管中，标记好样本后于-80 ℃存放备用。②提取总RNA按照Trizol说明书进行操作，使用已灭活RNA酶的EP管、枪尖等耗材及试剂，操作中严格防止RNA酶污染。每个样本最后提取得到50 μL的总RNA水溶液。③总RNA鉴定：总RNA反转录前，随机抽取4个样本，用酶标仪进行浓度和纯度的测定：在样品池中加入98 μL蒸馏水和2 μL总RNA样本(稀释50倍)；蒸馏水调零，上机检测样本浓度及A260/A280比值以测定RNA纯度。同时取5 μL总RNA进行1.2%琼脂糖凝胶电泳(88 V，45 min)，UV下观察总RNA完整性。④反转录：使用SYBR PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录反应。反应体系的配制在冰上进行，配制完成后立即放入FTC2000 PCR合成仪，进行反转录反应。反应条件为37 ℃，15 min(反转录)；85 ℃，5 s(反转录酶失活)。反转录完成后，将所得cDNA样本于-20 ℃存放备用。
实验采用20 μL反应体系，在冰上避光进行配制，配制完成后立即放入ABI PRISM 7300 Fast Real-Time System中进行反应。反应步骤如下：95 ℃预变性30 s 1个循环，PCR反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共45个循环，熔解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s共一个循环。
PCR扩增反应成后，系统自动绘制扩增曲线和熔解曲线，并采集CT值。为减少误差，每个样本设3个复孔进行反应。PCR扩增反应完成后，系统自动绘制扩增曲线和熔解曲线，并采集CT值。采用∆Ct法来评价实验结

C

B

A

图1 体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞形态观察(×100)
Figure 1 Morphology of in vitro cultured cells (×100)
图注：图A可见24 h后贴壁细胞数量还较少，但部分细胞呈多角形或梭形生长(箭头所示)；B为培养3 d，可见细胞数量明显增加，细胞基本呈梭形并聚集成团(箭头所示)；C为培养5 d后，可见细胞数量进一步增加，成片状生长(箭头所示)。

A

B

C

D

图2 骨髓间充质干细胞免疫组织化学鉴定结果(×200)
Figure 2 Immunohistochemical staining of bone marrow mesenchymal stem cells (×200)
图注：图中A，B分别为CD34(-)、CD45(-)，可见细胞浆和细胞膜基本呈透明，细胞核呈淡蓝色(箭头所示)，整个细胞染色浅，没有阳性颗粒存在；C，D分别为 CD29(+)、CD44(+)(箭头所示)，细胞膜上和细胞浆内均可见阳性颗粒，整个细胞呈棕色，细胞核呈深棕色。

检测基因及内参的引物序列：
基因

引物序列
COL3a1
Forward
Reverse
CTG GAG ATA AGG GTG AAG GT
GGG GGC CTC CTT CAC CCT TCT C
Col1a
Forward
Reverse
GAA GCA CAT CTG GTT TGG AG
TTG GGG TTG AGG GTT TTA CA
碱性磷酸酶
Forward
Reverse
CCA AAG GCT TCT TCT TGC TG
CCA CCA AAT GTG AAG ACG TG

果。首先根据系统采集到的每个样本的各个基因的CT值来计算其∆Ct值：∆Ct =CT目的基因-CT内参(β-actin)。再根据阳性对照组及实验组样本(N，Nh，US1，US2，US3，Ush)和阴性对照组样本©的∆Ct值计算∆∆Ct值：∆∆Ct=∆Ct实验组-∆Ct对照组。然后计算2-∆∆Ct的值，即样本目的基因相对于阴性对照组样本的目的基因变化的倍数。如果2-∆∆Ct > 1，则说明样本基因相对上调；如果2-∆∆Ct < 1，则说明样本基因相对下调为对照组的2-∆∆Ct×100%。
1.4.3 Western Blot检测雌激素对目的基因的蛋白表达的影响 ①用细胞刮收集来自雌激素组和对照组的细胞。根据细胞量加入适量蛋白裂解液，用枪尖吹打混匀，冰上裂解30 min，4 ℃离心12 000×g，20 min，收集上清液，以20 μL分装；②应用BCA试剂盒检测标本总蛋白的浓度；③SDS-PAGE电泳；④转膜：取出胶在转移缓冲液中平衡10 min，选择合适的转膜电压和时间。转膜放置如下：海绵(阴极)→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵(阳极)；⑤免疫杂交⑥显色及灰度值计算：将膜放入干净的平皿中，加入已配好的TAB显色液，持续 5-30 min。待显色后拿出膜放入清水中定影。Chemidoc XRS采集图像，Quantity One 4.52软件分析灰度值。
1.5 主要观察指标 ①体外培养的细胞形态学观察。②骨髓间充质干细胞免疫组织化学鉴定结果。③雌激素对Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白及碱性磷酸酶基因蛋白表达的影响。

2 结果 Results
2.1 细胞形态学观察 原代培养24 h后，可见细胞贴壁呈类圆形或多角形，部分细胞成集落样生长。72 h后，贴壁细胞数量明显增多，多数梭形细胞聚集成团，呈现克隆样生长特点。5 d时细胞相互融合，成片生长(图1A-C)。
2.2 骨髓间充质干细胞免疫组织化学鉴定结果 免疫组织化学染色鉴定结果符合比格犬骨髓间充质干细胞表面抗原特征：CD34、CD45在该细胞中呈阴性，细胞浆和细胞膜基本透明，没有阳性颗粒存在。而CD29、CD44在该细胞中呈阳性，细胞浆内和细胞膜上可以棕色或褐色颗粒(图2)。

碱性磷酸酶mRNA相对变化倍数
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0

12
10
8
6
4
2
0

Ⅰ型胶原mRNA相对变化倍数
图3 雌激素对Ⅰ型胶原mRNA及碱性磷酸酶基因表达的影响
Figure 3 Effects of estrogen on mRNA expression of alkaline phosphatase, type I and III collagen
图注：雌激素可以增加Ⅰ型胶原mRNA的表达，对碱性磷酸酶基因的表达没有影响。

空白对照组 雌激素组
空白对照组 雌激素组

1.6
1.2
0.8
0.4
0

1.2

0.8

0.4

0

空白对照组 雌激素组
Ⅲ型胶原蛋白表达水平

碱性磷酸酶蛋白表达水平
空白对照组 雌激素组

β-actin

Ⅰ型胶原

Ⅲ型胶原

碱性磷酸酶
Ⅰ型胶原蛋白表达水平

空白对照组 雌激素组
空白对照组 雌激素组
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0

图4 雌激素对Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白及碱性磷酸酶蛋白表达的影响
Figure 4 Effects of estrogen on protein expression of alkaline phosphatase, type I and III collagen
图注：雌激素可以增加Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原蛋白的表达，对碱性磷酸酶蛋白的表达没有影响。

2.3 雌激素对目的基因表达的影响 PCR结果(图3)显示：雌激素可以增加Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA的表达，但对于Ⅰ型胶原，雌激素的作用更为显著。而雌激素对碱性磷酸酶基因的表达没有影响。
2.4 雌激素对目的基因的蛋白表达影响 Western Blot结果(图4)显示：雌激素对骨髓间充质干细胞进行干预后，目的蛋白的表达变化和基因变化趋势一致。雌激素可以增加Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白的表达，但是雌激素更能显著刺激骨髓间充质干细胞产生Ⅰ型胶原蛋白，而雌激素对碱性磷酸酶蛋白的表达没有影响。

3 讨论 Discussion
雌激素内分泌系统的重要组成部分，是源于胆固醇的一类含18个C原子(C18)的类固醇激素，在体内以3种形式存在，即17β-雌二醇、雌酮和雌三醇，其中E2生理活性最强[10-13]。实验中看到外源性的雌激素E2能够促进不同程度的促进Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达，其促进这些基因表达的具体机制还不是非常清楚，但是有研究提示雌激素可能是通过pI3k-Akt途径促进Ⅰ型胶原表达的[14-15]，但是这一假设还需要更加深入的实验来说明。
牙周膜在体内能够维持结构稳定及良好的功能状态，在牙周组织再生中防止骨与牙骨质粘连，这一特点与牙周膜中生物活性物质的调节作用有关。牙周膜的一个重要特点是在整个生命过程中维持正常的宽度，虽然牙周膜细胞有形成矿化组织的能力，但体内的牙周膜能够保持生理性的未矿化状态，维持其结构和功能稳定，推测可能在牙周膜中存在一种调节机制可以抑制成骨细胞分化，维持和平衡牙周膜成纤维细胞表型，在骨改建中能够控制骨生成的程度。但作为未来临床推广应用，牙周膜干细胞获得相对困难，不易满足临床治疗需要。骨髓干细胞除具有自我更新和多向分化的潜能外， 还具有很强的可塑性，在一定的诱导条件下能分化为多种细胞，且取材方便、培养容易、增殖较快。
近年来，随着对干细胞研究的深入，骨髓干细胞越发受到重视。众多体内外实验表明细胞因子可以影响骨髓干细胞移植的微环境[16]，进而影响骨髓间充质干细胞的动员、迁移及分化。近年来研究发现将同种异体的或异种的间充质干细胞通过局部直接注射、蛛网膜下腔植入、动脉、静脉移植等途径植入后[17-19]，在受者体内并未发生免疫排斥，表明骨髓干细胞具有特殊的免疫学特征：①表达组织相容性复合物Ⅰ而不表达组织相容性复合物Ⅱ，且缺乏共刺激因子的表达， 因此免疫原性较弱[20]；②能直接或间接抑制T细胞的功能， 同时对CD4+和CD8+淋巴细胞也有抑制作用[21]；③具有免疫调节的功能[22]。综合这些原因，骨髓间充质干细胞适合于自体移植， 具有对病灶的趋化特性， 是良好的转基因治疗的靶细胞。
比格犬骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法已十分成熟，目前主要有密度梯度离心法、全血反复贴壁法、流式细胞仪或免疫磁珠分选法分离及纯化的方法，文献报告较多，本文不再赘述。研究选择了反复贴壁法，原因在于：①操作简便；②减少离心等步骤，降低细胞的污染和损伤风险；③和免疫磁珠分选及流式抗体分选这两种方式相比，贴壁法更经济，能够满足本实验需要。但是，反复贴壁法的一大缺点是无法获得单克隆来源的干细胞，后者获得的唯一方式是有限稀释克隆法，这样得到的细胞属同一克隆来源，能更好排除干扰因素。但是有限稀释克隆法获得细胞的效率较低，因为本实验需要大量的干细胞进行体内外实验，所以没有采用此法，因此获得的是多克隆来源的干细胞，作者通过混合传代来增加细胞的均质性。
一系列研究显示，Ⅲ型胶原等生物活性物质均具有抑制矿化的作用，可能参与维持牙周膜结构和功能的稳定[23-24]。Ⅲ型胶原占牙周膜的11.73%，是牙周膜重要组成成分之一，而且Ⅲ型胶原的高表达水平可能表明干细胞正在分泌修复过程的信号[25-26]。Ⅰ型胶原是牙周膜纤维中最主要的成分之一，占牙周膜的78.6%，是牙周韧带组织和骨基质的主要组成部分，是骨生成和胶原形成的一个标志物。碱性磷酸酶是骨组织成熟矿化的标志之一，是牙周干细胞向成骨分化的一个标志。碱性磷酸酶为成骨细胞沉积钙盐的必需，可从侧面反映细胞的成骨活性，用来和成纤维细胞鉴别，也是成骨细胞分化最早的指标[27]。碱性磷酸酶被认为与骨骼的形成有关。
从结果看来，总的来说，雌激素能够不同程度的刺激Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达。Ⅰ型胶原是牙周膜纤维中最主要的成分之一，而Ⅲ型胶原能阻止矿化基质的沉积，可能对维持正常牙周膜间隙不被矿化有一定的作用[28]，因此体外实验可以证明骨髓间充质干细胞在雌激素的刺激下，可能朝着牙周膜纤维细胞方向分化并且使相关的抑制矿化的基因和蛋白表达增加，这为促进牙周再生提供了一个有力的支持和证据。其次，从柱形图上还可以看到在抑制碱性磷酸酶蛋白表达方面，雌激素无明显的抑制作用，这些体外研究结果与之前其他学者在体内研究观察到的现象是相符合的。可以推测，如将这一结果应用于体内实验，那么受到趋化的干细胞的数量也会随着增加，从而一方面增加植入的干细胞在所需部位的定植率，一方面趋化体内的干细胞到所需部位。

作者贡献：实验设计、实施为彭伟，实验评估为秦媛，资料收集为李坤河。
利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。
伦理问题：实验动物在戊巴妥纳麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。
作者声明：第一作者彭伟、通讯作者陈松龄对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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