Broadford法测蛋白浓度.doc

一、原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin―酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。因此考马斯亮蓝法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。但考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成的复合物是蓝色溶液，使该染料的最大吸收λmax的位置从465变成了595，在595nm处有最大吸收值。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，因此利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
优点：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
注：测定时要在染色后520分钟内测定光吸收，不可太快，我之前就不小心吃了这个亏，弄得数据很不稳定。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
缺点：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作曲线时通常选用 g―球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

二、操作方法
1.试剂
（1）标准蛋白质溶液，用 g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。（颜色是褐红色，不能用R-250，R-250的颜色是蓝色的，要小心别弄错哦）
2. 标准曲线测定法
注：样品的添加量问题要注意一下，我之前看有的资料说加1ml,有的资料加0.1ml,我都给弄混了，现在终于弄明白，其实：
样品的添加量取决于你要测的蛋白的浓度，要浓度稀时，加1ml的量(即加样品后，用水补充到1ml)；浓度较大或适中时，加0.1ml
3.操作过程：（加至1ml的）
分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。
蛋白质标准曲线测定加样
试剂 空白 1 2 3 4 5
100ug/ml牛血清清蛋白/ml 1.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8
牛血清清蛋白/ug 0 10 20 40 60 80
去离子水/ml 0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2
考马斯亮蓝G-250试剂/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
吸光值A595
加至0.1ml的，基本过程同上，数据是上面的1/10：各试管的试剂添加量如下，
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
标准蛋白溶液（mL）
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.15mol/L NaCl（mL）
0.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
考马斯亮蓝试剂（mL）
5mL

4. 测量蛋白样品
配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。
在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。

3.试剂配置
a.牛血清清蛋白标准液 结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为100 ug/ml的蛋白溶液。
b.考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到1000ml。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250、质量浓度为0.085g/ml磷酸。