叶绿体的分离及荧光染色观察.doc

叶绿体的分离及荧光染色观察
泮力菁 2011级生物基地 201100140091 同组者：商倩倩
【实验目的】
1、 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和方法；
2、 熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光；
3、 复习巩固制片及染色的基本技术。

【实验原理】
1、 真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。细胞质中含有若干细胞器和细胞骨架，这些结构被称为亚细胞组分。分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。
2、 差速离心和密度梯度离心：
差速离心法是在密度均一的介质中由低速到高速的逐级离心用于分离不同大小的物体。离心速度逐渐提高，样品会按先大后小的顺序沉淀。在差速离心中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质网和高尔基体。最后为核糖核蛋白复合体。由于各种细胞器在大小和密度上可能相互重叠。一般差速离心2-3次，分离效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。若对产物纯度的要求较高，则需要密度梯度离心来分离纯化。
密度梯度离心法是利用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。它是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。
3、 荧光：
光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态进入基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。紫外辐射，可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。
荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并立即激发在极短的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长大于激发波长（损失热能）；C、荧光强度小于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。猝灭剂等，因此可以先拍照，后观察）；E、荧光强度取决于激发光强度，被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片、盖玻片和香柏油）。
荧光显微镜的光源有汞灯光源（提供激发光：U,V,B,G），疝灯光源：高峰值更宽，更稳定）。
4、 荧光显微镜及其操作的注意事项：
激发光源启动后，15min之内不得关闭电源一旦关闭电源，3min内不得重新启动；光路对中；选择相对应的激发滤片，阻断滤片和双色滤片；需照片时，应该及时拍照，否则效果可能会降低。激发滤片：得到想要的激发光；双色镜：三角棱镜。起分离激发光和荧光的作用；阻断滤片：阻挡未转化成荧光的激发光，三者组合成为激发滤块；荧光显微镜的物镜与标本离得较近，用于多收集荧光；
5、 染色剂吖啶橙：
A、 探针特性：AO是三环杂芳香类荧光探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光；AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核苷酸的磷酸发生静电间相互作用。强结合作用又称插入性方式。AO分子插入在双链核酸的碱基对之间，它们的结合能量为6-10kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合更加稳定，每插入一个AO分子，双链结构就发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子插入的数目，每隔三个碱基插入一个AO分子，这种方式的结合，主要是AO分子与DNA结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光。弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸和结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1，这种结合方式主要是AO分子与RNA结合，其发射波长为640nm呈红色荧光。AO愈合素昂的结合在低浓度下最佳，此时插入性强结合作用方式占优势。
B、AO的主要应用：对细胞内单链或双链DNA/RNA定性或定量测定；分析核酸内部结构及核酸的细胞成分构象；观察DNA凝胶电泳情况；作为细胞内PH梯度的显示剂，用来检测离子交换，钙离子诱导的质子浓度梯度变化等。

【实验器材】
1、 材料：新鲜菠菜；
2、 试剂：吖啶橙染色剂；0.35mol/L 的NaCl溶液；
3、 实验器材：普通或高速离心机；电子天平；荧光显微镜；剪刀；滴管；离心管；盖玻片，载玻片；镊子；普通显微镜等；

【实验步骤】
1、选取新鲜嫩滤菠菜叶,去叶梗及粗脉,洗净擦干，称30克放于150ml 0.35M.Nacl 溶液中；
2、将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆3–5分钟，转速5000r/min；
3、将匀浆用纱布(6层)过滤于500ml 烧杯中；
4、取滤液4ml在1000r /min 下离心2min；
5、取上层清液在3000r /min下离心5min(沉淀为叶绿体和细胞核混合物)；
6、将沉淀用2-3ml 0.35MNaCl 溶液悬浮；
7、取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下观察；
8、另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%的吖啶橙染料，混匀，盖上盖片，在荧光显微镜下观察。
9、另取新鲜叶片，从叶片的下表面撕取表皮制成装片，在普通显微镜及荧光显微镜下分别观察气孔及气孔周围的叶绿体。
【实验结果】
1 实验图片：
叶绿体
气孔

图1：普通光学显微镜下的菠菜叶片表面气孔

图2：荧光显微镜下的气孔周围的叶绿体（红色）（右为放大后的涂片）
叶绿体

图3：普通光学显微镜下的叶绿体

图4：荧光显微镜下的叶绿体 图5：吖啶橙染色后荧光显微镜下的叶绿体
2、 实验结果：
A、 气孔为成对存在的肾形保卫细胞构成，保卫细胞中含有叶绿体，保卫细胞中的叶绿体发出红色荧光并围绕气孔排列一圈（如图1图2）；
B、 普通光学显微镜下，叶绿体为绿色，橄榄形，若在高倍镜下观察，可以看到叶绿体内部含有颜色较深的绿色小颗粒，即基粒；
C、 使用荧光显微镜，在选用B激发滤片，B双色镜和O530阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光；
D、 加入吖啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，视野中亮绿色的为细胞核碎片等杂质。
3、 实验结果分析：
A、 在普通显微镜下，观察到气孔由两个保卫细胞组成，然而因为镜头有污染，可以看到照片的正中央位置有些模糊；
B、 在荧光显微镜下观察到保卫细胞内部的叶绿体，放大后更加明显，却也有一些模糊；背景为黑色，说明其他的结构没有自发荧光；
C、 普通光学显微镜下可以看到绿色橄榄形的叶绿体，还有其他的一些杂质，如细胞核碎片等，但是杂质不是绿色，可以区分；
D、 荧光显微镜下的游离叶绿体发出火红色的荧光，可以看到，叶绿体较多，背景为黑色
E、 吖啶橙染色后在荧光显微镜下观察，可以看到橘红色的叶绿体以及亮绿色的细胞核碎片等杂质，背景为较亮的黄绿色，说明悬液中其他的杂质存在；
F、 总体来说，此次实验的结果较为理想，找到了应该找到的结构，并进行了拍照记录，学习了使用荧光显微镜；

【实验反思与总结】
1、 注意事项：
A、 要得到完整的，有活性的叶绿体，需在低温下迅速提取，图片后立即观察；
B、 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察时，会受到许多因素的影响，如温度、光、猝灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应立即拍照。
C、 在制作荧光标本时，最好使用无荧光载玻片，无荧光盖玻片和无荧光香柏油；
D 用菠菜叶提取叶绿体时，尽量使用鲜嫩的菠菜，去掉梗，打碎叶片时转速不可以过高，否则叶绿体也会遭到一定的破坏；
E、 在撕取菠菜叶表皮时，应该选用下表皮并且厚度适中，在1.35M的氯化钠溶液中铺平，盖盖玻片时尽量保证无气泡；
F、 由于荧光会慢慢变得不明显，最好吖啶橙染色后立即拍照观察，在照片上分析，这就要求拍照要迅速清晰；

2、 思考题：
A、 在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化？
答：有变化,因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量的高低，更换不同的滤片，激发光会不同，叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一样。
B、 游离叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无差异？为什么？
答：有区别，因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合作用，这会消耗掉一部分所吸收的光，所以最后释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小，颜色和荧光强度就会有差别。
C、 根据观察的实验现象，描述自发荧光和次生荧光的区别？
答：某些物质受激发光照射后课直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光，称自发荧光（直接荧光）。
某些物质本身不发荧光，但他经荧光染料染色后，再通过紫外线照射也能够发出荧光，这种荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可发出橘红色荧光。
D、 叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？
答：匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，手机类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体（差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度。也可同离心力以及悬浮介质的粘度有关，在一定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率不同；依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分）叶绿体的分离应该在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤；分离过程最好在0-5摄氏度的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
3、 实验小结：
此次实验的主要内容是叶绿体的分离与荧光染色观察，并没有涉及用密度梯度离心进行纯化的过程，因此可以看到，在用吖啶橙染色后，仍然有除去橘红色的染色之外的亮绿色以及绿色的背景，说明含有细胞核碎片及其他的杂质，但是叶绿体仍然能够很明显的区分出来；此次实验学会了用荧光显微镜，并且在荧光显微镜下进行拍照。荧光显微镜下的保卫细胞中的叶绿体以及游离的叶绿体都是会自发产生火红色的荧光，说明叶绿体可以自发荧光。
此次实验，锻炼了我的实验技能以及合作能力，巩固了制片与染色的实验技能，我学到了荧光显微镜的结构及光路原理以及使用的注意事项，并且学会了分离细胞器的方法。

【参考文献】
《细胞生物学实验》第三版，高等教育出版社，王崇英，高清祥。