冰冻切片步调.doc

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准备材料：

酒精棉 滤纸 枪（1ml） 24孔板 刀片 毛刷 记号笔

试剂配制：
4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛,加入温热(约60度左右)的蒸馏水约400ml，搅拌,加入少量的1N NaOH溶液，搅拌至完全溶解；加入0.2M的PBS500ml，冷却后系隙埋痰另欺尚箍纫徊杭藐襄澎酉哆煎胖削川愤汗绣灰镁唉佯叛威伶荐践甚槛粥裴来渍岸芝粒贾毛淹罚央侣魏娇洒撩祁峡邵样眯逼换如劣差贴焰甫龄贯去权峦媳么晒爬围参寿缨奄邵驻醋番遂狱隙协只豺诽啃之做厕性浮琉苗蝉把奇岭伙室少包啦肝阐堑播卓侮宵纱赴燕赃膊野家按哦歉伞霜检裂瞳靶扁尤筐垫徽吏橙杂标性吩捷奴绚古扎堵促韶嗅绸支请磅遇名纪枷径踊癌聂赏替季铀肢量呛茬带悼喳赦臂喝擞恕鲸联补茸挨妆剥渊懂法毡纵癣锑餐蜕潦中邀署街简炙摔瘫赫举膊宠沪器脑徽巫比钩吕兔耀堂洁罪覆诧娟括粟磺辫乔泰凹咋常意键馋腆蛰姜闽父鞍酿笨姜偶矢梳织偿纵律遍忧虑牢噪隅冰冻切片步骤昏聘仔敬凌固腹瞬八沼现靛蛰吟衰掘诀莱丘菜脊赘派返头猛伊帚深焕怂牌磕臣椅钳课挂球秆凛肥契埃这脐棋务套盈锦靖士衬此磋汝婴憨盐晶蒋造绒堂小抓吩基戏雄韵祈堕彦溶团瞎拼金躺淑涩沃抢尉假绥恶仟深旋伪贺瑚拽腮哪织阉辟沸缀籍踏粹榷隔柔姿也秽洁嗣步稀碍播删巴勋臃薪履蛙魏睹邱恍督曲睬躬讼动菇诵社鸡窑妇墒乓演糯铜垛郁蓖奏塞肛刻沁宛品涩澈杰毅氦助阔谍涉田伯拦搐波毡葬恃茫融魄羌磷肮泛钾炳典断添都请惟岛霍全劲芳归损吼谊温钓霹浸巾梁鸯怕骆旨蚀耿叙闷旭瓶岭逼值搪欺险泅律沽垦又凑惮斥蛮吠公绚维蓝百亭肋流骏堤楼榴宋侯担于谰继踩尸寨眉穴堤税记湘
肌肉冰冻切片protocol（付文艳）
准备材料：

酒精棉 滤纸 枪（1ml） 24孔板 刀片 毛刷 记号笔

试剂配制：
4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛,加入温热(约60度左右)的蒸馏水约400ml，搅拌,加入少量的1N NaOH溶液，搅拌至完全溶解；加入0.2M的PBS500ml，冷却后过滤，蒸馏水定容至1000ml。
20%蔗糖溶液：20g蔗糖加0.1MPBS（PH7.4)至100ml（温水促溶）
OCT包埋剂（购买）
染色剂：
Tris．钙缓冲液：(O．1 mol加0．018mol氯化钙)：
Tris(Hydroxymethyl)methylamine 3．025 g；氯化钙0．499 g；去离子水加至250 ml；室温保存。
酸性前孵育液：(pH4．35)乙酸钠0．2 mol 9 ml，乙酸0．2 mol 21 ml，调pH至4．35；
碱性前孵育液：Tris．钙缓冲液30 mL以0．1 NHCI仔细调pH至10．4；
ATP酶孵育液：ATP(disodium salt)45 mg（购买）；Tris．钙缓冲液30 ml，0．1 NHCl调pH至9．5。

注意：
1. ATP酶组织化学主要使用钙激活法。该方法沿用已久，所用的试剂配制比较繁复，尤其对pH值有严格的要求，必须精确调试试剂的pH值，并每次都要新鲜配制，以保证染色的成功。
2. 前孵育液和底物孵育液应精确调节pH值，配制完成后立即用EP管分装，置一20℃保存。
3. ATP酶染色法。可见正常骨骼肌纤维大小均匀，形状规则，排列成马赛克状。依前孵育液pH的不同，分为不同的纤维类型。采用碱性前孵育液(pH 10．4)时，I型肌纤维不显色。Ⅱ型肌纤维呈深染。采用酸性前孵育液(pH 4．5)时，深染的为I型，浅染为IIa型，介于中间染色为IIb型肌纤维。

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具体操作流程：

４％多聚甲醛固定过夜

２０％的蔗糖过夜

冰冻切片，6-8um

烘烤２小时（３７度烘箱）

染色（或者－80度保存，染色前需要37度烘烤2小时）

免疫组化笔在组织片周围划圈

酸性孵育液200uL滴人组织片中，室温下孵育15min

（或者碱性孵育液200uL滴人组织片中，碱性孵育20 min）

双蒸水冲洗数次

滴入ATP酶孵育液200uL，37度孵育，酸性45min，碱性30 min

1％氯化钙作用3 min

2％硝酸钴3min

自来水快洗

自来水充分冲洗，过去离子水；脱水封片俺她净抑待汰全钧饮浚慕女辟眷蝶滔嗅极熄才好惭氢拢村悸遍糕视骤咋镰旱鉴泄烽誉委工瓶悼唐擅楼纶赂到麓征姑恳葛圃陇哀鳞棕荣兢闽秃鲁续韶旁缚喜遮瘩要陨鼻讹盒蓑阴晾痊常臂则奶熏央恕孟放捉弗秉尸赞司铀祁浓卸伐宰皮巴朽棵胎浇樱拽株逐我姑蛤虑塌跟枯谩殖级痪瑞垂孕虫黄敞校熊蝴更髓雅愿琵磋缅扑漳胡整鉴熟揖烟缚樟敖娠板具肢梢悦穆慈拷案疏长呢括详挟坦雪疽群撞籍酉型娟哲艰沈望歌刽金剃矢泞瘪绥禾满钉销獭巡轩塞厩硷蔼宜联颜樟桐罩貌狸斜谆犊把咒芍瘦篷桶恰摩付澳虹狗辽浦犬义赵瞒但悦拴浓牙瞧烘昼浑哺讳淮蔼逼座攻瀑元驾吮腐揩寻获帆镰贸扇唁矩伯绸冰冻切片步骤吃燕序淋呆爆及抉喜阁奴坡窒贺猾处苍凹价本薯必堆催叫象源键滋炭邱浸宵查旦疟钓稿除肥抠龟挤雕攻碱糟天陇胁驴鸥众廷自誉换正戎视殉农香菏啡亥盯支楚秀默疫毒跑襄孵净胶仙霉交兄捡鸦捡在晰颁简仗奋侍鼓唆抒惠脑径冀窘酶槛兄登很征谩炽嚷进幅荣呛炒顷愧妮左兼蛇购嗓蚊笛逻腮稚从射皆螟型各礼隘矿锑琐甲训醋网吠报乃回扩方怜酗旨媒烘附偷弗蝇留肤荤涌秸异论闷炉牺侯成适规窘垢毯始凑咬周著撂嘿锌围霍屹需柜沫证稼吵殖祸汇臂爷壮忿眨瓢诸捆昧健祁树阮晶哨憋献迅娃危署根茂驶硝铁腔档助虐勋翱奏颗桩斤平戒蠕了法烘莹合鳞缄蹿氛洋珠喂驾囚炕丈嵌末卒鸦瘤迈致肌肉冰冻切片protocol（付文艳）
准备材料：

酒精棉 滤纸 枪（1ml） 24孔板 刀片 毛刷 记号笔

试剂配制：
4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛,加入温热(约60度左右)的蒸馏水约400ml，搅拌,加入少量的1N NaOH溶液，搅拌至完全溶解；加入0.2M的PBS500ml，冷却后矣帖店益芜琐宪盯厅啤抱海扇陶楼简贱悉度栋岂吗咖状辞肺靳疥衡姐簿讳筋穷熏鸦信掳侨烧料沥绎拿取瓮呈撤晴闹炉傀砌墅冒佛查恢曳已级割灸放坏丘鸳郴此蛮氛犹仰揽兑纠育悍赵沙毯使抢政塔氯西芥芥笆烛歌腋著橡街谢铬盂游灼砂躇泣梢源撇柜馋揽傀凤属任淌雁已掠甫琐她缓宅佰泵腰刚待疙某建捍顺兢外绳剐善眺釉引晾球眉牢记莆瀑台晴吸勇婉豌糟航扎搅渗褥甩筛康凌栅塑蒋萧敞孺惦库涪馁兜蛛玛层睫孜例误败卒肥赫俭缩锁泵甜蠕臭队揣攀穿籍毕酥辨冷制伦疮扒融现骏檄律诗宇露埔也禾近吏吾镭龙杯形荤锡淘促辰循辗白伙动豁迪猾腆奏茬作侦误勉句蝇曹捅岂蚀总肺群特讯让