逆转录病毒载体(课堂PPT).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,逆转录病毒载体,1,目前，多数研究集中在将外源基因 插人到基因组的某个位置，以促进或抑制某种特定基因的表 达，这就要求有一种可以将外源基因引入机体细胞中的运载 工具，而逆转录病毒载体正是迎合了这种需要而产生的。逆转录病毒载体是根据逆转录病毒的特性设计出的一种病毒表达载体。,2,逆转录病毒是一种单链 R N A病毒，它是能 够在逆转录酶的作用下将 R N A转变成 c D N A，再在 D N A复 制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。一般来说，逆转录病毒 R N A基因组的核心部分都包括三个开放的读码结构：g a g一编码病毒的核心蛋 白、p o l 一编码逆转录酶、e n v一 编码病毒的被膜糖蛋白。,3,应用机理,这种病毒表达载体是将 g a g、p o l、e n v 等三个基因的大部分或全部除去，由于没有 g a g、p o l、e n v三个基因的存在而不能够产生有感染性的病毒颗粒，因此，人们又设计出了一种特殊的包装细胞株。,4,这种包装细胞株能够表达 逆转录病毒的全部蛋白，逆转录病毒载体在整合入宿主基因组后，可以与包装细胞形成的病毒缺失蛋白重组成具有感染能力的病毒颗粒。,5,将收集的病毒颗粒感染靶细胞就可以将目的基因整合到靶细胞染色体上，基因活性得到表达。而目的基因可以通过细胞分裂传给下一代子细胞。永久稳定地表达目的蛋白。,6,应用,用于基因治疗,外源基因表达,7,基因治疗,逆转录病毒载体无疑是在基因治疗中传递目的基因最有效的运载工具，广泛应用于人类基因治疗的研究中。应用逆转录病毒载体，携带所要表达的目的基因，可以用于基因相关疾病的检测及治疗。,8,用于腺苷脱胺酶缺陷症的治疗,1 9 9 0年，W F r e n c h A n d e r s o n在美国实施的第一例基因治 疗就是应用逆转录病毒载体治疗腺苷脱氨酶缺陷症(A D A)。腺苷脱氨酶(A D A)缺乏症是一种严重的免疫缺陷症，腺苷脱氨酶的缺乏可使 T淋巴细胞因该酶缺乏后一些代谢产物的累积而死亡，从而导致严重的联合性免疫缺陷症(S C I D)。手术 取得了良好的效果，术后并没有发现患者的不良反应。,9,用于癌症的治疗,目前，逆转录病毒载体在癌症治疗方面被广泛的研究，传统的化疗方法虽然能够抑制癌细胞的生长，延长患者的生命，但对患者的机体也有很大损害，因此，人们开始研究在分子水平上抑制或消灭癌细胞，逆转录病毒载体在此方面具有着巨大的应用潜力。,10,刘颖斌 等人将对癌细胞具有抑制作用的ANGPTL4基因与逆转录病毒载体相连，用脂质体法将重组病毒粒子感染人肝癌细胞 Hep Gz。结果显示人肝癌细胞生长速度 明显减缓，重组逆转录病毒载体所介导的人ANGPTL4基因转移很可能是一种有效的肝癌基因治疗方式。,11,逆转录病毒载体在后天获得性遗传疾病如艾滋病及其基础性研究川，神经系统疾病,等疾病的治疗方面同样有着巨大的应用潜力，因此受到人们的广泛研究。,12,外源基因表达,用于基因工程疫苗的研制,逆转录病毒载体作为一种表达载体，可以整合到动物细胞染色体上，不断的表达其所携带的蛋白。应用这一特性，将编码主要致病基因的保护性抗原基因连接在载体上，使其 在哺乳动物细胞中表达蛋白，刺激机体产生相应抗体，为制备动物基因工程亚单位疫苗、基因工程 D N A疫苗的研制开辟了一条新的路径。,13,RN A 干扰,简单地说，RNA干扰是指一种分子生物学上由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。,逆转录病毒载体介导的 R N A i 技术可以长期稳定表达siRNA,从而实现基因的稳定沉默。,14,问题,对环境条件要求高,在不适条件下，重组逆转录病毒会失去其感染能力，因此，保持逆转录病毒的存在最适条件是非常关键的。,插入诱变,逆转录病毒载体经过包装后产生的病毒插入到基因组中可引起基因突变。,15,癌基因激活,由于逆转录病毒载体的插入，使原来存在于宿主染色体上的癌基因被激活，而引起癌症.,引起机体免疫反应而被清除,转录病毒载体用于基因治疗最终会用于体内，由于机体内复杂的免疫环境，有可能当逆转录病毒进入体内，在没有整合到染色体上时就被清除。,16,错配率高,逆转录病毒用于基因治疗的另一个不利之处在于，其在逆 转录过程中有很高的错误率，这种逆转录过程错误率可导致在基因治疗过程中宿主细胞程序性死亡或基因突变。,17,应用前景,目前，基因治疗被越来越多应用于疾病治疗，而作为基因治疗中不可或缺的 目的基因运载工具，逆转录病毒载体以其能够稳定，永久地整合到宿主染色体上，并稳定表达目的基因，日益受到更多的科研工作者的关注。,18,但 由于目前我们所涉及的领域更多的还是体外研究，当逆转录病毒载体用于体内治疗时就会更多地涉及到应用安全问题、载体产物问题、基因在寄主细胞中的表达控制问题等。,19,如何提高病毒的感染效力，并持久稳定地表达目的基因是今后研究逆转录病毒载体应用的一个重要内容。,20,在疾病疫苗研究方面，应用逆转录病毒载体的特性，用相应疾病的抗原基因构建表达载体，同时，可以对载体进行改造，减少机体对表达蛋白的免疫作用，提高目的基因的蛋白表达量。,21,另外，国外已有学者将逆转录病毒载体应用于生殖细胞研究，其意义更加深远，也为逆转录病毒载体的研究打开了新思路，让机体从最初就形成某些疾病的抗体。,22,Thanks for you attention!,23,