细菌内毒素检查验证方案模板.doc

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验 证 文 件
********公司 文件编号：********
文件编号：**-**-**

验证文件

注射用********
细菌内毒素检查法验证方案

********公司
目 录

1 适用范围
2 目的
3 责任人
4 样品的来源及实验准备
5 内毒素限值的确定
6 具体验证步骤
5.1 鲎试剂灵敏度复核
5.2 干扰实验
5.3 供试品的内毒素检查
7 注射用********细菌内毒素检查方法
1 适用范围
本验证方案适用于注射用********细菌内毒素检查法的验证。
2 目的
建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。
3 责任人
细菌内毒素检验员、QC主管。
4 样品的来源及实验准备
4.1 样品的来源、使用的主要试剂及实验条件和仪器
注射用********注射用溶剂：批号20100201(规格： 5ml) 生产厂：********公司
注射用********：批号20100201(规格：500mg) 生产厂：********公司
鲎试剂（标示灵敏度为：0.25EU/ml） 批号：1110192 规格：0.1ml 生产厂：湛江安度斯生物有限公司
鲎试剂（标示灵敏度为：0.5EU/ml） 批号：1101050 规格：0.1ml 生产厂：湛江博康生物有限公司
细菌内毒素检查用水：批号：1201160 规格：2ml/支 生产厂：湛江安度斯生物有限公司

细菌内毒素工作标准品：批号1004020 效价：12EU/支 生产单位：湛江安度斯生物有限公司
实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。其他玻璃实验用具：250℃1小时灭菌处理后使用。
4.2 实验准备
4.2.1 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。
4.2.2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
5 内毒素限值的确定
根据2010年版中国药典二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法中规定，细菌内毒素限值计算公式：
L=K/M
式中 L为供试品的细菌内毒素限值，本品以EU/mg表示；
K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5EU/（kg．h）；
M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。本品以腺苷蛋氨酸计最大剂量为1000mg。
L=5EU/（kg．h）*60kg*1h/1000mg=0.3EU/mg
因此本品的细菌内毒素限值为0.3EU/mg。
6 具体验证步骤
6.1 鲎试剂灵敏度复核
6.1.1 实验操作
6.1.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备
取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟。
6.1.1.2 待复核鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
6.1.1.3 加样
将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4 支（管）4 列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。
6.1.1.4.加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2 分钟。
6.1.1.5 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）
6.1.2 实验结果计算
如最大浓度2.0λ4管均为阳性最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。
λc = lg-1 (∑X/4)
式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
6.1.3 结果判断
6.1.3.1 判断标准
当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
6.1.3.2 判断结果：（记录附后）

6.2 干扰实验
目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。

6.2.1 确定最大有效稀释倍数（MVD）
样品溶液的制备：取注射用********适量（约相当于含腺苷蛋氨酸500mg）加入注射用溶剂5ml，再用细菌内毒素检查用水稀释至每1ml含腺苷蛋氨酸10mg的溶液。本品内毒素限值为0.3EU/mg。
MVD=cL/λ
L=0.3EU/ml c=10mg/ml λ1=0.5 EU/ml，λ2=0.25 EU/ml
因此MVD1=6，MVD2=12

6.2.2 操作方法
6.2.2.1 制备内毒素标准对照溶液
取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（方法同6.1.1.1.）。
6.2.2.2 制备含内毒素的供试品溶液
取注射用********加入注射用溶剂并制成每1ml含腺苷蛋氨酸10mg的溶液，再根据MVD加入细菌内毒素检查用水稀释，再用此稀释液将6.2.3.1.中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。
6.2.2.3 鲎试剂的准备及加样
取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
6.2.2.4 加样
将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的含2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。
6.2.3 实验结果计算
如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照, 管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et).
Es= lg-1 (∑Xs/4)
Et= lg-1 (∑Xt/4)
Xs、Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
6.2.4 结果判断
6.2.4.1 判断标准
当Es在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且Et在0.5 Es～2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰实验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。
当Et不在0.5 Es～2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。
6.2.4.2 判断结果：（记录附后）

6.3 供试品细菌内毒素检查
在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。
6.3.1 操作方法
6.3.1.1 供试品溶液的制备：（稀释倍数不得超过MVD）

6.3.1.2 阳性对照溶液的制备
用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准溶液（方法同6.1.1.1 ）。
6.3.1.3 供试品阳性对照溶液的制备
用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。（方法同6.2.2.2 供试品阳性对照溶液的制备）。
6.3.1.4 阴性对照液用细菌内毒素检查用水
6.3.1.5 鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
6.3.1.6.加样取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管（NC），2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。
6.3.1.7 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
6.3.2 结果判断
6.3.2.1 判断标准
当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验有效。若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2 管均为阳性，应认为不符合规定；如2 管中1管为阳性，1 管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2 管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MVD。
6.3.2.2 判断结果：（记录附后）

7 注射用********细菌内毒素检查方法
通过注射用********的检验，确定注射用********细菌内毒素检查法：

质量负责人： 审核人： 检验人；