PCR技术及应用JYH.pptx

l PCR的定义l PCR的原理l PCR反应体系的的成分及其作用l PCR反应体系的优化l PCR技术的特点l PCR产物的检测方法l PCR技术在临床检验中的应用 一、PCR的定义lPCR（polymerase chain reaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。是近年来发展起来的一种体外扩增DNA片段的技术。l PCR技术是由美国 的Kary Mullis 于1985年发明，用此方法可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。由于PCR方法带来的革命性作用，Kary Mullis 本人因此获1993年诺贝尔化学奖。二、PCR技术的原理 PCR技术，其原理是模拟天然DNA的复制过程：以拟扩增的DNA分子为模板，在DNA聚合酶的作用下，以一对分别与模板5末端和3末端互补的引物（寡核苷酸片段）引导下，按照半保留复制的机制合成新的子链DNA的过程，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到不断的扩增。二、PCR技术的原理 PCR反应主要分为三个步骤：变性、退火、延反应主要分为三个步骤：变性、退火、延伸。伸。1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链碱基间的氢键断裂而形成两条单链的过程。温度一般为90-95度。2.退火(复性)(Annealling):温度降低温度降低后，变性后的DNADNA与引物与引物与引物与引物按碱基配对原则互补结合的过程。温度一般为Tm-5度。二、PCR技术的原理 3.延伸(Extension):在适宜温度下，在DNA聚合酶作用下，以4种 dNTPs等为 原料，从引物的 3 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链的过程。耐热DNA聚合酶最适温度为72。上述上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环量就增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过的模板，经过35个循环后，理论上个循环后，理论上DNA的量可达到的量可达到235倍。倍。PCR 的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C PCR的指数扩增（2n）引物引物引物引物5 5 5 5 3 3 3 3 第一次循环第一次循环第一次循环第一次循环第二次循环第二次循环第二次循环第二次循环第第n次循环次循环二、PCR技术的原理1.缓冲液：缓冲液：l 10 50 mM Tris-Cl(pH8.4)：维持 Taq 酶作用环境的偏碱性l 25 50 mM KCl：促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。l 100g/ml 牛血清白蛋白(BSA)：对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。三、PCR反应体系的的成分及其作用 2.MgCl2Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，浓度一般为1.5 2.0 mM，浓度过高能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP。浓度一般为0.05 0.2 mM。过高能加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。过低则反应速度下降，但可提高实验的精确性。三、PCR反应体系的的成分及其作用 4.引物引物(Primer)：是一段寡核苷酸片段，即预扩增核酸片段两端的已知序列。浓度一般为0.2 1 uM，偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。5.Taq DNA 聚合酶：聚合酶：耐高热，最初从火山口细菌中提取，具有连接酶活性和5 端至 3端的外切酶活性。目前市售的均为克隆表达产物。三、PCR反应体系的的成分及其作用 6.模板模板DNA(Template):l 可以是DNA，也可以是RNA，RNA的扩增首先需逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环。l 待扩增的核酸需部分纯化，使核酸标本中不含蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。l 模板的量一般微克水平或102 105 拷贝，过高会引起非特异产物的增加；过低则产量降低。7.水：水：去离子水，补足整个反应体积。三、PCR反应体系的的成分及其作用 10buffer：130/10=3l MgCl2:1.530/25=1.8l dNTPs:0.230/10=0.6l 引物引物 P：0.4302/10=2.4l Taq 酶酶(5U/l)：1/5=0.2l 模板：模板：1l 水：水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21lPCR反应体系：反应体系：30ul 四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化：1、温度、循环参数：、温度、循环参数：变性温度和时间：变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热9095，30 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 30，可使各种复杂的DNA分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化：复性温度和时间：复性温度和时间：PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15 25 bp 之间时，复性温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般位于40 60，30 60 s。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。一般情况下选择55 30，足以使引物与模板之间完全结合。四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化：延伸温度和时间：延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度70 75 之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 75。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 1。四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化：循环数：循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说25 30次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，30 35次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。PCR扩增的特点基线期、指数期、平台期PCR程序四、四、PCR反应条件优化：反应条件优化：2、PCR反应体系成分的优化反应体系成分的优化l MgCl2浓度：1.5 2.0 mMl 模板：l dNTP：0.05 0.2 mMl 引物：0.2 1 M 注：引物设计总原则是提高扩增的效率和特异性。引物设计原则引物设计原则 长度1530 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 55%左右。引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在 3 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。引物设计原则引物设计原则 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。引物的 5 末端碱基：并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其 5 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不影响PCR反应进行。引物设计原则引物设计原则 引物的 3 末端碱基：原则上要求引物的3末端与模板DNA一定要配对，另外 3末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。引物3末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。引物设计软件：Primer7.0、Oligo6.0五、PCR技术的特点l 高度灵敏l 高特异性l 简便快捷1、凝胶电泳分析法：l 琼脂糖凝胶电泳l 聚丙烯酰胺凝胶电泳2、分子杂交：基因芯片和原位杂交3、限制性内切酶酶切分析：点突变4、测序5、Real-time PCR：不是对PCR终产物进行检测六、六、PCR产物的检测方法产物的检测方法Real-time（实时荧光定量）PCR原理：原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知量模板进 定量分析的方法。检测方法：1.SYBRGreen法:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光 信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。注：PCR产物熔解曲线图(单一峰图表明PCR扩增产物的单一性)2.TaqMan探针法（单链DNA探针）:探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子 形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。Real-time（实时荧光定量）PCRTaqMan探针法扩增曲线分析设置：基线和阈值线扩增曲线分析基线：3-15循环基线：1-3循环标准曲线：Ct值与logC0成反比七、七、PCR技术在临床检验中的应用技术在临床检验中的应用1、在常见病原体检测中的应用：HBV-DNA、HCV-RNA、EB-DNA、HCMV-DNA、MP-DNA、UU-DNA、CT-DNA、HSV2-DNA、NG-DNA2、分子遗传学研究：基因变异、表达、重组、进化等3、医学诊断：遗传病、基因病、癌变、代谢性遗传病等4、法医学鉴定5、组织器官移植配型：HLA-SSP配型