植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 园艺植物种质资源离体保留,种质保留（,germplasm conservation,）是指利用天然或人工创造适宜环境保留种质资源，使个体中所含遗传物质保持其遗传完整性和较高活力，并能经过繁殖将其遗传性传递下去。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第1页,种质资源保留,常规种质资源保留方法,1965,年,Henshaw,和,Morel,首次提出,germplasm conservation in vitro,；,1982,年国际植物遗传资源委员会专门成立了离体保留咨询委员会,(advise committee on in vitro storage),。,种质资源离体保留,（,germplasm conservation in vitro,）：限制生长保留和超低温保留,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第2页,一、限制生长保留,限制生长保留,（,restricting conservation,）是指改变培养物生长外界环境条件，限制离体保留材料生长速度，使细胞生长降至最小程度，但不死亡，从而到达延长继代培养时间目标。,当前使用较多限制细胞生长办法有,改变培养环境,（如降低培养温度、降低培养瓶内氧气含量、降低光照等）、,提升培养基渗透压,、,加入生长抑制剂,、,饥饿法,、,失水干燥保留,等,。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第3页,低温保留,低温保留又称微生长保留或最小生长法，是利用植物生命活动伴随温度降低而减弱甚至几乎完全停顿原理，将外植体在低温条件下，结合其它不适合生长环境条件，从而抑制或延缓离体培养物生长和发育，延长寿命、到达种质保留目标。,低温保留种质惯用温度范围有,3,种：常温（,20,5,）、常低温（,0,15,）、低温（,-80,0,）。,低温保留是种质资源短期和中期保留惯用方法。,主要适用再生植株、分生组织培养物保留,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第4页,2.,干燥保留,将愈伤组织或体细胞胚等培养物，适当干燥失水，移入适宜低温下，可成功保留种质。,（,1,）预处理：将蔗糖浓度增至,0.15mol/L,或更高，预处理,12-20d,。,（,2,）干燥：包含胶囊化处理（,encapasulation treatment,）和脱水处理（,desiccation treatment,）等方法。,（,3,）储备：通常选取,0,以上低温，或室温储备。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第5页,3.,生长抑制保留,采取生长抑制剂或生长延缓剂延缓培养物生长，延长保留时间。,如采取,3mg/L,ABA,使草莓试管苗在,25,1,常温下保留,12,个月，存活率,62.5%,；延长,5,个月保留时间。在,62,保留,15,个月，存活率,100%,惯用生长延缓剂有,ABA,、多效唑（,PP,333,）、矮壮素（,CCC,）和比久,(B9),和生长抑制剂三碘苯甲酸（,TIBA,）、烯效唑（,S-3307,）和青鲜素（,MH,）等。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第6页,4.,高渗透压保留,提升培养基渗透压能够一直培养材料生长。如在培养基中添加渗透化合物，如高浓度蔗糖、甘露醇、山梨醇等。,蔗糖浓度由,3%,提升到,10%,左右，可显著抑制培养物生长。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第7页,二、超低温保留,超低温保留是指在,-80,至,-196,甚至更低温度下进行生物材料保留。,在超低温环境下，植物活细胞代谢和生长几乎完全停顿，植物处于相对稳定状态，但能保持正常活性和形态发生能力，从而到达长久保留目标，在适宜条件下可快速繁殖，再生出新植株，并保持原来遗传特征。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第8页,保持细胞培养物遗传稳定性；,2.,长久保留植物种质资源,;,长久保留农作物优良品种及其育种亲本材料种质；,建立长久保留茎尖分生组织种质库及无病毒原种；,5.,保留试验材料，预防再培养中遗传变异。,超低温保留作用及意义,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第9页,（一）超低温保留原理,在低于,-80,0,C,超低温条件下，有机体细胞内部生化反应极其迟缓，甚至终止。所以采取适当方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当方法将冻存生物材料恢复至常温时，其内部生化反应可恢复正常。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第10页,冷冻保留,是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加,冷冻保护剂,溶液中，以一定冷冻速率降至零下某一温度（,普通是低于,-80,0,C,超低温条件,），并在此温度下对其长久保留过程。,而,复苏,是以一定复温速率将冻存体外培养物或生物活性材料恢复到常温过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养器官都能够进行冻存，并在适当条件下复苏。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第11页,水在低于零度条件下会结冰。假如将细胞悬浮在纯水中，伴随温度降低，,细胞内外水分,都会结冰，所形成冰晶会造成细胞膜和细胞器破坏而引发细胞死亡。这种因细胞内部结冰而造成细胞损伤称为细胞内,冰晶损伤,。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第12页,假如将细胞悬浮在溶液中，伴随温度降低，细胞外部水分会首先结冰，从而使得未结冰溶液中电解质浓度升高。假如将细胞暴露在这么高溶质溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会所以进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保留溶液中溶质浓度升高而造成细胞损伤称为,溶质损伤或称溶液损伤。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第13页,当温度深入下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。不过假如在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受,溶质损伤,和,冰晶损伤,。,因为冷冻保护剂轻易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，降低冰晶形成,，而且经过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保留。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第14页,在复苏时，普通以很快速度升温，,1-2,分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大冰晶，也不会暴露在高浓度电解质溶液中过长时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生,，冻存细胞经复苏后仍保持其正常结构和功效。冷冻保护剂对细胞冷冻保护效果还与,冷冻速率、冷冻温度和复温速率,相关。而且不一样冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第15页,1.,主要仪器设备,(1),用于组织和细胞培养全套设备；,(2),普通冰箱；,(3)-70-80,超低温冰箱；,(4),程序降温仪；,（二）超低温保留基本设备和程序,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第16页,(5),玻璃或塑料试管（,5ml,或,10 m1,），封盖严密，不进液氮；,(6),液氮,;,(7),光学显微镜和紫外荧光显微镜；,(8),分光光度计。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第17页,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第18页,2.,基本程序,(1),材料准备与选择。,(2),预处理。,(3),将材料装入试管，并随即插入冰浴中。,(4),加入,0,预冷冰保护剂，在,0(,冰浴中,),放置,30,一,45,分钟。,(5),降温冰冻。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第19页,(6),保留后化冻：普通在,3740,温水浴中快速化冻。,(7),活力测定,通常采取,TTC,法,(,氯化三苯四氮唑还原法,),。假如是单细胞或原生质体，可采取活性荧光素染色法，显示活细胞，统计存活率。,(8),再培养，观察组织细胞恢复生长速度、存活率、植株再生能力。,(9),遗传性状分析：如植株形态特征、生长发育情况、染色体、同工酶及抗逆性等。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第20页,1,材料特征；,植物种子、茎尖、花粉胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等均可用于超低温保留。,但基因型、抗冻性、器官组织和细胞年纪、生理状态影响,存活率。,含有丰富稠密、未液泡化细胞质，细胞壁薄，体积小，分裂相细胞百分比高，细胞内自由水含量低细胞适宜超低温保留。,2,预处理,目标：,A.,增加细胞分裂和同时化；,B.,降低细胞内自由水含量；,C.,增强细胞抗寒性。,（三）影响超低温保留效果主要原因,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第21页,预处理方法：,(1),继代培养,:,细胞、组织继代培养中细胞分裂分化同时化调控，增加指数生长久细胞。,(2),预培养,:,增加培养基中糖浓度，提升渗透压；或在预培养基中加入诱导抗寒力物质或冰冻保护剂，如脱落酸,(ABA),，山梨糖醇、脯氨酸及二甲基亚砜,(DMSO),等。,(3),低温锻炼：如香石竹茎尖经,4,低温预处理,14,天，不但提升了存活率而且分化率从,30,增加到,60,。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第22页,3,冰冻保护剂,迄今，已经报道了各种类型冰冻保护剂。分为渗透性和非渗透性冰冻保护剂。前者如二甲基亚砜,(DMSO),、甘油、乙二醇、乙酰胺等，后者有蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇,(PEG),、聚乙烯吡咯烷酮（,PVP),等。,但作为冰冻保护剂物质应该具备以下特征：（,1,）易溶于水；,（,2,）在适当浓度下对细胞无毒；,（,3,）,化冻后轻易从组织细胞中去除。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第23页,冷冻保护剂作用：,(1),降低冰点，促进过冷却和“玻璃态化”形成；,(2),提升溶液粘滞性，阻止冰晶生长，,(3)DMSO,可使膜物质分子重新分布，增加细胞膜透性，在温度降低时，加速细胞内水流到细胞外结冰，预防细胞内结冰伤害；,(4),稳定细胞内大分子结构，尤其是膜结构，阻止低温伤害，非透性保护剂主要作用在质膜上。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第24页,4,降温冰冻方法,(1),快速冰冻法：将材料从,0,，或者其它预处理温度,(,如木本植物冬芽在,-3-10,预处理,20,天,),直接投入液氮。其降温速度在每分钟,l000,以上。,适合高度脱水材料，如种子、花粉、冬芽等。,植物体内水分在降温冰冻过程中，,从,-10,到,-140,是冰晶形成和增加危险温度区，,在,-140,以下，冰晶不再增生。所以，快速冰冻法成功关键在于，利用超速冷冻，使细胞内水分快速经过冰晶生长危险温度区，即细胞内水分还未来得及形成冰晶中心，就降到了,-196,安全温度，从而防止了细胞内结冰危险。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第25页,(2),慢速冰冻法：通常成熟植物细胞都含有大液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来，不宜采取快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在条件下，采取慢速冰冻法。,以每分钟,0.1-10,降温速度,(,普通,12分很好,),。降到,-70,左右,，,随即浸入液氮，或者以此种速度连续降到,-196,。在这种降温速度下，能够使细胞内水分有充分时间不停流到细胞外结冰，从而使细胞内水分降低到最低程度，到达良好脱水效应，防止细胞内结冰。,该方法适合用于成熟含有大液泡和含水量高细胞。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第26页,(3),两步冰冻法：这种方法是慢冻法和快冻法结合，或者说，是一个改良慢冻法。第一步是用慢速降温法从,0,降到一定预冻温度，并停留一段时间，使细胞到达适当保护性脱水；第二步，投入液氮中快速冰冻。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第27页,(4),逐层冰冻法：此方法是制备不一样等级温度冰浴，如,-10,，,-15,，,-23,，,-35,，或,-40,等。保留材料经冰冻保护剂在,0,预处理后，逐步经过这些温度，样品在每级温度上停留一定时间,(46,分钟,),，然后浸入液氮。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第28页,5.,冷冻保留：,超低温保留冷源有干冰（,-79,）,、超低温冰箱（,-80,-150,），液氮蒸汽相（,-140,）和液氮（,-196,）等，以液氮最为惯用。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第29页,6,解冻方法,试验证据证实，,植物冻害常发生在冰凉和化冻两个过程,。,所以要使植物种质超低温保留取得成功，不但要求有一个适当降温冰冻程序，而且还要求采取适当解冻方法，以防止在解冻过程中产生细胞内次生结冰，并应预防在解冻吸水过程中水渗透冲击对细胞膜体系破坏。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第30页,通常采取快速解冻方法，即将液氮保留后材料在,37-40,温水浴中化冻。因为超低温冰冻材料化冻时，再次结冰危险温度区域大约是,-50,至,-10,。从理论上说，借助快速化冻速度经过此温度区，从而防止细胞内次生结冰。,慢速解冻是将液氮中保留材料先置于,0,低温下解冻，再逐层升至室温下进行解冻慢速解冻能够使水分迟缓深入细胞，防止因强烈渗透而造成水分对细胞膜破坏，适合含水量较少材料，如木本植物冬芽。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第31页,7,再培养：,指已解冻材料重新置于培养基上使其恢复生长过程。再培养是检验冷冻保留效果或确定保留方法是否适合最根本方法。黑暗条件下有利于超低温保留培养物恢复生长。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第32页,显示细跑活力,TTC,法,(,氯化三苯四氮唑还原法,),，反应脱氢酶活力。,2,显示细胞存活率二醋酸酯荧光素,(FDA),染色法，反应酯酶脱脂化作用，或采取中性红染色法。,3.,再培养 新鲜培养基上培养。存在停滞期。,（四）超低温保留后细胞活力、存活率及遗传特征观察,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第33页,4.,遗传性状分析：,1),细胞全能性保持：形态发生能力表示情况。,2),后代形态特征及生长发育情况。,3),后代染色体分析。,4),同工酶谱分析。,5),特殊产物分析。,6),抗逆性分析。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第34页,芽及茎尖分生组织超低温保留,1,、茎尖超低温保留植物种类：,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第35页,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第36页,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第37页,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第38页,2.,茎尖分生组织超低温保留程序（基于保护性脱水）：,（,1,）,种子消毒灭菌,，种子经,70,酒精快速漂洗，,10,漂白粉溶液消毒,20,分钟，无菌水洗涤,4,次,(2),在无菌条件下播种,于具润湿滤纸灭菌培养瓶或培养皿内。置于,2528,培养箱中黑暗培养。,(3),萌发,生长,45,天后，在无菌条件下切取茎尖分生组织，,0.3,一,0.5mm,长,，第,1,对叶原基。在实体解副镜下进行操作。,(4),将切取,茎尖分生组织接种于固体,B5,培养基上，内含,0.5pmol,L BA,及,5%DMSO,，光照,16,小时，温度,20,15,预培养,48,小时。,(5),预培养后，将培养瓶浸入,冰浴中,2,小时,。,(6),将茎尖分生组织,转移到在冰浴中预冷含有,1m1,液体,B5,培养基离心管,中。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第39页,(7),逐步,加入等体积预冷,10,DMSO,，在,30,分钟内加完，使,DMSO,最终浓度为,5%,，,然后再放置,10,一,30,分钟,(8),密封离心管口，,以每分钟降低,0.6,速度慢速降温到,40,，然后浸入液氮中,(196),。,(9),在液氮中贮存,定时期后，,取出材料在,27,水浴中快速化冻,。化冻后马上将试管转移到冰浴中,(10),用等体积,B5,培养基,在,30,分钟内，分,6,次逐步加入试管中。,(11),吸去混合液，并用,B 5,培养基洗涤,4,次。然后将,茎尖分生组织转移到固体,B5,分化培养基,上。,3,周后可分化成苗。植株再生率达,70,以上，已经有试验表明，贮存,2,年多仍能存活植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第40页,Sakai(1990),和,Yamada(1991),建立了一个茎尖分生组织超低温保留简便方法，即,玻璃化超低温保留,，该技术关键是，,在冰冻前，采取高浓度冰冻保护剂使保留材料脱水，以致不需要慢速程序降温，从室温直接浸入液氯，,即可取得很高存活率。,玻璃化超低温,保留优点：,（,1,）不需要昂贵程序降温仪；（,2,）防止细胞内外冰晶形成；（,3,）适合各种外植体。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第41页,基于玻璃化处理结合快速降温超低温保留方法：,（,1,）玻璃化法：,是指冰冻保护剂对材料进行预处理后，再用高浓度玻璃化保护剂进行脱水处理，然后快速投入液氮保留。,基本程序：,材料选择,-,预处理,-,装载,-,玻璃化保护剂脱水处理,-,液氮保留,-,解冻和洗涤,-,活性检测和恢复培养。,（,2,）包埋,-,脱水法：,将包含样品海藻酸钠溶液滴入高钙溶液，固化成球状颗粒，同时辅以高浓度蔗糖预处理样品，使样品取得高抗冻力和抗脱水力。,基本程序：,材料选择,-,海藻酸钠包埋样品,-,高浓度蔗糖预培养,-,无菌培养或硅胶中进行干燥脱水,-,马上投入液氮,-,快速化冻,-,活性检测。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第42页,（,3,）包埋,-,玻璃化法：,综合了璃化法和包埋脱水法优点而建立方法。区分是在脱水处理时用玻璃化溶液代替干燥过程，然后使包埋珠和玻璃化溶液一同进入玻璃化。易于操作，脱水时间短，能同时处理大量材料，存活率高。是茎尖分生组织保留理想方法。,基本程序：,材料选择,-,预处理,-,海藻酸钙包埋,-,玻璃化溶液处理,-,液氮保留,-,快速解冻,-,恢复培养。,（,4,）干燥冷冻法：,快速冷冻保留方法，将样品在含有高浓度渗透化合物培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌空气干燥脱水数小时，或者用海藻酸钙液包埋样品，无菌风深入干燥，然后投入到液氮中保留。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第43页,（,5,）预培养法：,将保留材料在含有低温保护剂培养基上预培养一段时间以诱导脱水，然后投入到液氮中保留，惯用高浓度蔗糖预培养，另外在含有,PEG,和,DMSO,培养基上对材料进行预培养也能够提升保留存活率。,（,6,）预培养干燥法：,是与培养法和干燥法结合，材料现在含有低温保护剂培养基上预培养并进行干燥，然后投入到液氮中保留。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第44页,茎尖分生组织玻璃化法超低温保留程序：,(1),从试管苗中切取茎尖分生组织。,(2),在含,1.2 mo1,L,山梨糖醇,B5,培养基上,4,预培养,2,天。,(3),将预培养后分生组织放入试管，,然后加入高浓度冰冻保护剂,PVS,2,。即在含,0.4 mo1,L,蔗糖,B5,培养基中溶解,30,(w,v),甘油，,15,(W,v)乙二醇和,15,(w,V)DMSO,，在,25,停留,5,分钟，或者在,0,停留,15,分钟，期间更换,2,次溶液。,(4),直接浸入液氮保留。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第45页,(5),贮存一定时间后，,在,25,水浴中快速化冻，,为,280,分。,(6),化冻后，倒出保护剂，,将材料放入含,1.2 moI,L,蔗糖,B5,培养基中，,2510,分钟。,(7),转移到固体,B 5,培养基上灭菌滤纸上。,1,天后，再转移到新鲜一样培养基滤纸上，,25,、,l 4,小时光照下培养。,3,天内恢复生长，,3,周后产生成苗，成苗率,(,存活率,),达,8090,。,该方法也适合用于愈伤组织及悬浮培养细胞。,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第46页,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第47页,年,4,月,2,日,植物细胞组织和器官超低温保存专家讲座,第48页,