SC∕T 7022-2020 对虾体内的病毒扩增和保存方法(水产).pdf

ICS 65.020.30 41 :才叫中华人民共和国水产行业标准SC/ T 7022-2020 对虾体内的病毒扩增和保存方法In vivo proliferation and preservation method of viruses with penaeid shrimp 2020-08-26发 布2021-01-01实施二中华人民共和国农业农村部发布; 本标fHIII1叫7/Ci标刊i化技术委bi会(SAC/TC156)川rlo本标捕，也iJJFftt|1网水产科学研究Jll1梅水JZU研究所.本标月i斗:22:起fA人:11J:宜、杨冰、JA1Jf、邱元、李l二、怅!大革11、梁!色。SC/T 7022-2020 SC/T 7022一2020对虾体内的病毒扩增和保存方法1 范围标准给IL了对虾体l人l (JJ耐高扩增平保存的缩Ill各fl 、试剂和l材料、r.异，U平II设备，规定了川虾体内的州市扩增trl保存的操作在骤。本标准适用于x,JYfF体坷的协，：年扩增平II，（，飞t=.2 规范性引用文件3 4 试剂和材料4. 2 1、N缓冲液：见附录Ar:j:i(I、5 器材和设备5. 1 匀浆r.tL5. 2 高j冷的离心机。5. 3 超速冷冻离心机。5. 4 电子显微镜。6 操作步骤6. 1 实验动物选择6. 1. 1 选界养成m阶段的SPF凡纳院xJ虾（Litenaeus vannmei）或其他品和11 SPF x,l虾，暂养7 d。6. l. 2 随机挑取对虾个体，按GB丁28630. J、GB丁28630.2、GB/T 28630. ：， GB丁28630. 4, G 13丁SC/T 7022- 2020 28630.5、G/丁25878或OIE(水生动物f虫病i:1!Jr于Jllt)第二;j分(I(J要求逃行州EiL检测，liffJ认实验动物无特定11J.JJt。6. 2 病毒扩增6.2 1 采川肌肉在则为式，11iJX.J 川、制报j体iGH-I稀粹的州市)f10L/g，注射后创头在1、l虾体内短忻作胃1)1级仪拔出。也IIf使川病iJij:位ill千j反向iliJ汤.!.i且i业JIJ病df感染组织ill行投ul1方式，不1 ，;J.j(.J虾病t姑娘染力式见农1。按非l的病存TII71似E.(E对虾体内ill行有效的?可tlt打呐。表1对虾体内的病毒扩增方法参数说明祸，1i超i主肉(.、阶段梢，:J.11;:tm.r-liJ.且向j且梢，!柿子1i- ，:;扩J白1:侦川的ETJ心)JIAi心阶段H!川的病，在粒子靶m织，l心)J(X!()冉l捕，!i名iJ、太小Jfj状!l旦旦2方式(XJ.，)，fIIJ)甘心11 11;1nn;ll、l时间1ll1ll mll1 白斑r，;介11病Ai(70-170)X 树叶1状躁、W，III先l、二应JUlIMEM 30000布13082000和120( 飞.v气V)(210-.120) ，f1IMi币组织:成投ni!告染ttb:F.& i1i 111 肥、.wltll织、ilIl:JJUlIJ tU J ml.l;f)itJi;: ,:;: 20-22 一llf刑事?t1il守、1先FL应启i或llt叫出145 000启1210140000呐1180 (111门NV)，;hfi组织!ff古且lfUUlJ.小死.10 I-m体肌肉、绵绵!u织.JII肌肉口M205 000 同1180 286 200和120病，:;(IMNV)ilt巴、淋巳 椒TlDX 1业I挑.Fr:t;-;介1il:l2 J卜mf.牛鲍、l1!Iflt细织、淋巴肌肉tHI205 000刷1120 I:ll 000启1120 的，在crSV)如il:和叮1:，F 1:1.U-;宇成投Ili.:J.:梢1:1:1，1;1 1 (1 10-50) X 们状胞、i!iIfIl组织、血淋IUlfJm射100 0001同1901(YHVI) (150-180) U和淋巴剧川等100 000刷190I) 11虹彩IUlI安JtUJ、1与，:1 (1lIVI) 150-160 +而i小选I也组织.血淋巴投1山!.x反1:1)36 :lOO和12050200冉1180汹肠偷夕t血flrl忖呐苟17. 1-:l7. 6 -I-rJj体跑、附版、111脚跟、JUlI士JtiM或J:l0 000布1240l(O 000)白12110(CMNV) 淋巴?l:r投1I16. 2 2 )(，Hfr农Jtll:lJ(J d豆感染的典型临床症状11中，技6.J. 2 W骤检测，确忘;/iIi 阳性后，取濒死)(.11.r JlJ =FNi 75粗捉。6. 3 病毒粗提6.3. 1 收病自感染的创组织切成小干0.5cmX O. 5 crnX O. 5 crn的组织块。6.3.2 JJI人JO1体积百!冷的TN缓冲液，冰浴 1 JO 000 r/min匀浆JOs，iflu6-J浆1次-:1汰。6. 3. 3 6-J浆后，茬儿乍J.直il裂i刷，TJ队:J1II人适irlJj冷的rN级il液，搅拌均匀。6 3. 4 寄生j浆液分装于肉心位;rlJ l,:j j韭冷冻JZi心机I000 Xg， lIOCrLl心10rnino 6.3.5 收集上沽，经400日筛il过i后，ji-J冰的的饶杯i，。6. 3. 6 .，j，k;布料子大l匀-f220 11m, Jj.过?但依次经1.0 fm平110.45f-m U(I(JJj.探过Ji百分浆，ift州，11;粒子小r220 nm.泌过l蓝侬次绞1.0rn，0.451.1111平11O. 22 fm孔径(I(JN过J1l J百分装。6.4 病毒纯化(以wssv为例l6. 4. 1 lX 6. :1. 6 (I(HI; ，jj，中flt且液.th!扎l:斜.jJ，j和I1)JII人适MT:JI冷的IN缓冲液树籽，30000Xg.loC超边74心30min.l仅叫l1f.心版，冰浴)1.川。6.4. 2 I止除部分U，i/，JI Ji以节仍衍，吹过、在iiIt在J(;jljj虫街沉淀ui甘松散杂质.)11民除残余UIli/L6. 4 3 川m怜的TN级冲液夜没说拉;，11分，将前心JUi倾斜J)I.，r冰面上.*沉淀部位冰龄4h- J2 ho 2 SC/T 7022- 2020 6. 4. 4 观察沉淀基本悬浮II，J，轻轻吹洗，也沉淀全部怂浮.转移于新的同心信1，:1500 X且， lOC离心5 mino 6. 4. 5 收集上11!液，30O X耳，40C超速离心:10min，1以除部分I消液，JTJI吸笛轻轻吹去被-.;1;11: n i)敛衔沉淀上的松散杂质，)11以除残余Li, 0 6.4.6 J11 1 mL2 mL的rN缓冲被夜没沉淀，冰的协):2 h-4 h，待沉淀悬浮1月，收集巷、被o6. 4. 7 于超速冷冻离心机Ic(JIj ，ci心笆中自上而下铺设浓度(W/W)材;皮介于20%66%的1日、糖济、液，40C放，:8 h 12 h后，职部缓慢注入6.4. 6的病15悬液，82OO X日，lOC离心2ho 6.4.8 1吸取病iZ所在才开1皮层的照柑j容液，放位于71t的超速向，C、1中，J11入10俯体积的丁N缓冲液，30000 Xg，.loC超速72i心30min，1以除Iii，液。6. 4. 9 川11mL2 mL的TN缓冲液浸没沉淀，/Jr伴们也Jh2h，待沉淀悬浮起来之后，分装。6.4. 10 病市纯化后，宜通过电子显微镜观察(if(认病毒颗粒元始归。注.对于l川H6. 4. 11 实!验阶主纣结J古i柬后，斗将每实牙盼帝中所有J接主刷仙触，、病原的实耳骑奇材料j均l巳均兰匀j参照阿附J录l巳主的E要LzF求处丑边迦i且!。6. 5 病毒保存6.5. 1 病71i感染的把组织使用液氮超低温保存法保存，JSim合SC/T7019-2015中附;K A的要求;或使用-80 oC fJ; ，i法保存，应价合SC/丁7019-201511咐-*:的要求。6.5. 2 病奇和i捉液使用液氮超低温保存法保存，应符合SCI丁7019-2015中附ZEA的要求，或侦JTJ- 80 o c ( i!;法保存，应11合SC/丁701920151阵J，*13 的要求。6. 5. 3 纯化的病毒粒子直立即使月)，JJll人10%NaN至终浓度为0.1%，于loCnl存放2个-j;或攸JIJ液氮超低1日i保存法保存，Jj.Z ;(:/合旦:(r7019-2015巾附*A tfr求;或使川-800CI东j1法保存，J.Jif8合立二n7019-2015中附录13fI要求。3 SC/T 7022-2020 4 TN tll)但丁民HCINCI )111;浴血i(，):二乎乎至l1l6-J)可训然11-1军7.附录A(规范性附录)试剂配方SC/T 7022-2020 附录H(资料性附录)水产病害诊断实验室染病动物及病原污染物的处理方法8.1 染病动物及病原污染物的范围水产病在J诊断实!J母室为了.lt行引t)g(1)珍断I1，;:J.t ):.t所断病害的病bil生物在保持ttIli I (I(jlsI况下.lt行必要的处理、;rm、浓缩J:1剖面i。在一珍断实验元j戊Jii.产1二叮能桃叶1年jYIJl.感染1币怕:(j 亥中l病房(生物的幸存的实验动物、:1;(阶材料、甜的洗W;i;府)1，或设备、f!f养胶水、j气匀，f，j属于染病动物生病J)在污染物。.2 各类染病动物及病原污染物的处理方法8. 2 1 幸存的实验动物幸存的实验动物应该捕杀，XJr传染性码或科劫丧失感染忆|的水生，;M却1ii:)JJit , :E尸体1lI技|含W i.l 剂粉末或HI沸71以烫，板将通垃放处础;)(，t+传染怕也或耐受)J强的仿照，1Ji.将动物尸体.lt行，:jJ在蒸汽iji5.然们J吉普通J:i.1及处础。8. 2 2 实验材料感染I污染的实验材料包机;m有病j反感染仍们的实验动物尸体、试剂、芳，养基、少地胶水刷次11:3.;T份丹:J(111匀。少茧的小!j.;!阶动物尸体、试剂、陆R;、少盐城水平jl一次I实驹)11川 等nf采川全Tell司)蒸汽泊iij后放作i且i垃圾处础。大tlt茧的小组实盼豆IJ!IM尸体平1_.次性实验月/111 :可集01焚化后校ill:iil垃圾处且11。大批:!rl:试剂;fM古JEJVt含i快地町的材料可111人(，1(ij首!HfIJ至有放ft;-tt达2000 mg/L的浓度保柿30mll1，然而按相应化于:gJ,j ,11o(/(j Jt:物处J11l!:求处卫Ho8. 2 3 待清洗的实验用品或设备H1平T2 000 mg/L有放(/9含jl :;1;剂m业的扫t或:Jr.，;!(t实验JrI，山或设备的农丽，11在i生IIZ-dj剂iti液中;:r包或似持表1MIfJ混5mll1，然后/:11川1，1水进行的iJt或擦拭。对r/fiI绞受 UJ浓度的合(，1(i .;:; filJ腐蚀的实验Ij品或设备的表rm,JH 3%的过低化组i，II;(或J刺式，然后再)IJi，171进行汕说:TIX擦拭。8.24 暂养后的废水衍m币的废水中111入7MUfltE剂，使有效刽浓度达到J2 000 mg/I.，保持:Wmin然后按111迎战水处剧。科i玄废水不存在JU也污染，百l再加l入1iJt代研L胶制至2000mg/L浓眩，搅拌混匀，放川/0m;n JFi:J1I放。8.25 气溶胶珍Ji平II:jHtf!2染力的生!n水生动物炊病或其州!片(.5(，卜F燥、紫外线匀lH受力弛(/(j水生动物lfr:lfJ不)lv.该在邻近水产!M或11然水域的地JEiilfJ可形成;:日开I大tt感染性污染的气mJR(/)实验工作.如1!f疗养I/，J的大hl充气。.lt行nJ形成大盐气i1iJJ( (rj 3i!J母.应凸二相应容器上在I Xil纺扩散illjJ段，必j!(/(j fji况下t/实验室JfI塑料)111院做成II(;iI/.JI同l桥，增加1气浴JJ:Ht1放的fiJ.。在一经iii进行l豆类工作的1、价室去装紫外线H. J/.JJIJ紫外线.lt行叫:ii!L d ONON-NNOh H川. , 1同农 业出版衬出版It京市朝阳I(友干m街18号楼).X . x !J:.IJI: www.ccap.CO) -ltJ;J:印刷一厂印刷新华I-1r1i北京友1jJiJi发行各地新华|川Ig;，:销。111政编的100125 兴兴2时1数15Ti 2020句.12月北京第1次印刷r:1Jl o. 75 二|弘苦16109. 8353 定价18.00元7川本吕80mmX1 230mrT! 1/16 2020年12!;:j 1版版权专有侵权必究举报电话[phone] SC/T