菜心过氧化物酶的提取论文.doc

菜心过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析
周伟竞
（广州大学生命科学学院）
摘　要: 为了探索菜心不同部位POD 活性及同工酶的种类, 以菜心的不同部位（菜花，叶，茎）为材料, 研究其在提取后及加工过程中POD 的活性及变化情况.发现茎的蛋白含量少，但POD活力强, 菜花的蛋白含量高，但POD的活性弱,通过同工酶的凝胶电泳分析，知道了花有两种同工酶，叶有三种同工酶，而茎只有一种
关　键　词:菜心 过氧化物酶 活性 同工酶
The Extraction of Peroxidase from Chinese Cabbage ， Its Active Property and the analysis of PAGE
Abstract: In order to explore different parts of cabbage types of POD activity and isoenzyes to different parts of cabbage (cauliflower, leaves and stems) were used to study in the extraction and processing of POD activity and changes. Found stem less protein, but POD activity is strong, cauliflower protein content, but POD activity is weak,by isoenzyme gel electrophoresis analysis, there are two isozymes known flower, leaf, there are three isozymes, the stem is only one
Keywords: cabbage peroxidase active isoenzymes
前言:过氧化物酶(POD)是广泛存在与各种动物、植物、微生物体内的一类氧化酶。过氧化物酶以西红素为辅基，参与了许多重要的生理过程如：细胞壁的合成，应激反应，生长调节等等 。过氧化物酶在植物细胞内主要分布在细胞壁，液泡，输导组织及膜结合核糖上。迄今过氧化物酶作为一种商品试剂也广泛用于免疫组织化学，电镜技术，酶联反应等生物学研究，并成为重要的诊断试剂。本试验对菜心中的过氧化物酶进行提取、分离、纯化，活性测定及同工酶的凝胶电泳分析较为系统地对菜心POD进行了研究。同工酶是来源于同一个体或组织, 能催化同一反应, 而酶蛋白结构不同、物理化学性质不同的一组酶.由于酶是基因表达的产物, 所以同工酶可用于鉴定基因型的差别, 也可作为研究生长发育的重要工具, 并且对于研究植物的抗病性也有帮助.
1 实验材料和方法
1．1 材料
新鲜菜心(购自附近市场)的花，叶，茎
1．2 仪器
电子天平
冰冻高速离心机
可见光分光光度计
电动玻璃匀浆机等
电泳仪
电泳槽
注射筒及针头
微量注射器
装凝胶用玻璃管（内径为5毫米、长度为90毫米）、
1．3 试剂
20mM KH2PO4，
100mM PBS：取0.2M Na2HPO4，87.7ml与0.2MNaH2PO4，12.3ml混合。
考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。
标准和待测蛋白质溶液
标准蛋白质溶液（各配100ml）：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。未知蛋白质溶液。
三羟甲基氨基甲烷（Tris），四甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰胺（Acr），甲叉双丙烯酰胺（Bir），甘氨酸，过硫酸铵，蔗糖，溴酚蓝，联苯胺，过氧化氢。
1．4 酶液的制备
1、称取植物材料1-2克，剪碎；
2、加入少许石英砂和3ml KH2PO4，快速研磨，再加入7ml KH2PO4研磨，后加入离心管中；
3、8500rpm， 15min；
4、取上清液，定容至10ml（刻度试管）。
此液即为POD提取液，取5ml冷冻保存，作为电泳的POD样品。
1．5蛋白浓度的测定—考马斯亮蓝法
1、 标准曲线
2、
3、 制作标准曲线回归方程：Y(含量)=aX(OD595值) + b， 得出相关系数R2。
根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。
1．6过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法）
1、备好酶液，将分光光度计调到470nm；
2、取光径1厘米的比色杯2只；
3、对照杯加反应混合液2.0 ml，KH2PO4 0.5ml，校零点。
4、样品管加入反应混合液2.0 ml，酶提取液0.5ml，立即计时，30秒或1分钟计1次，共计3分钟。
5、酶活力计算：
酶活性（△470/min mg蛋白）＝每分钟OD变化值/mg蛋白（或鲜重）
1．7过氧化物酶同工酶电泳
1、冰箱中拿出粗酶样品；
2、电泳槽的正确安装（二块玻璃、一把梳子，二个隔条），洗净、擦干，用胶带封好“ 凹”面，夹好。
3、PAGE胶的制作：每张胶20ml ，由 A、 B、 C及 水 四成份组成，
比例为： A:B:C:水＝25 ml: 5ml: 1ml: 11.5 ml;配好后，迅速注灌胶，之后插入梳子（一半深度），等待20-30min凝胶凝固后，去胶带，清洗碎胶，轻轻拨出梳子。
4、安装：将制的胶安装到电泳槽，凹面朝内，再用四个夹子固定，将缓冲液（需稀释10倍）加入到电极上下槽。
5、上样：酶样品与含溴酚蓝的50%蔗糖液混匀，比例为1 ml酶+1ml 溴酚蓝蔗糖液；上样量是厚胶（厚梳子）每孔40微升，薄胶（薄梳子）每孔20微升；
6、电泳：200V，1.5-2小时，取出凝胶；
7、染色：凝胶置于大培养皿染色，至斑带淡淡出现，
马上停止染色；
8、 漂洗：脱色液少量多次，脱出背景，然后用水漂洗；
2 结果与分析

样品蛋白浓度的测定
OD值
含量
0
0
0.381
5
0.545
10
0.732
15
0.937
20
1.057
25

过氧化物酶活性的测定
时间
OD值
部位
菜花
叶
茎
1min
0.149
0.224
0.385
2min
0.216
0.579
0.637
3min
0.288
0.895
0.882

部位
菜花
叶
茎
OD值
0.391
0.316
0.182
蛋白质含量（mg)
7.32
5.54
2.35

酶活力计算
部位
菜花
叶
茎
酶活性
0.0193
0.121
0.211
注：在活性测定中用了0.05ml蛋白溶液

从右到左依次是花，叶，茎（最后一个也是叶）从中可以看出花有两种同工酶，叶有三种同工酶，而茎只有一种。结果有点出乎意料，本以为茎的同工酶是最多的。

从图中可以看出不同部位过氧化物同工酶带还是略有差别,过氧化物同工酶的鉴定可以进一步用于品种鉴定以及评价品种的优劣.
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。（《植物过氧化物酶的研究进展》）
我一直疑惑的一个问题，过氧化物酶与过氧化氢酶有何不同?通过查资料得知，过氧化物酶与过氧化氢酶具有相似的化学性质，但却又有所不同。（《过氧化物酶与过氧化氢酶》）区别在于过氧化物酶对纯过氧化氢没有分解作用，但如果有合适的受体存在，则过氧化物酶能催化氧转移到这个受体上，而使受体被氧化，过氧化物酶可归人转移酶类。过氧化氢酶能使过氧化氢分解成水和氧，当有一定的受体存在时，则也有过氧化物酶的作用。 过氧化氢酶可以去除氧漂白残留在织物上过氧化氢，防止影响染色。
根据张龙翔和张庭芳的生化实验方法和技术，过氧化物同工酶产生的时间早适应环境的能力就会强一些（过氧化物同工酶产生的时间可能成为以后研究的一个课题）, 不同部位过氧化物同工酶表达的差别可以用于对植物生理生化的研究, 过氧化物同工酶的酶带丰富可能抗逆性要好, 这对于研究不同品种大白菜的品质会有所帮助.

致谢：
本实验得到了郭培国老师的悉心指导与胡良达同学大力帮助，谨此表示衷心的感谢。
参考文献：
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植物学研究，2001，19(4)：332—344．
[2] 朱忠勇．过氧化物酶与过氧化氢酶EJ]．临床检验杂志，
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[3]张龙翔，张庭芳．生化实验方法和技术[M]．北京：高等
教育出版社，1997．
[4]姜远良，冯春良．辣根过氧化物酶催化过氧化氢(H：O3)
及氧化邻苯二胺反应动力学研究E3]．光谱学与光谱分
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定E3]．上海交通大学学报，2003，21(2)：131—134．