20120314微生物检验注意事项.pptx

临床细菌学检验临床细菌学检验应关注的问题应关注的问题靖江市人民医院靖江市人民医院 周明先周明先2006年年12月月18 据英国媒体据英国媒体 报道，俗称报道，俗称“超级病菌超级病菌”MRSA（耐甲氧西林金黄（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的一个变种色葡萄球菌）的一个变种今年袭击了英国一家医院，今年袭击了英国一家医院，已造成已造成8人感染，其中人感染，其中2人人死亡死亡2004年受感染死亡的英国士年受感染死亡的英国士兵坎贝，兵坎贝，18岁，感染后岁，感染后48h死亡死亡美国弗吉尼亚州贝德福德一名17岁高中生就因感染MRSA而死亡，21所学校停课。阿什顿邦兹，07年10月4日感到身体一侧疼痛，就到当地一家医院就诊。10月17日死亡。抗生素时代，感染仍是抗生素时代，感染仍是人类健康的主要人类健康的主要“杀手杀手”微生物检验特别关注微生物检验特别关注保证有足够数量的活的细菌*正确的方法*正确的采集部位*在使用抗生素前或停药3天后采标本*尽快送检保证标本不被污染（无菌操作方法）保证不污染环境（生物安全）病人准备、标本采集及运送是微生物培养质量保证的重要环节之一。如果标本采集不当，即使有经验的实验室工作者及最好的仪器设备也难以弥补在采集标本时引入的误差和错误；标本采取与处理的规范化是准确、及时地向临床提供重要的临床感染信息的基础；标本采取与处理不符合要求，则微生物培养的结果毫无意义。微生物样本采集的基本原则1.1.及时采集微生物标本作病原学检查及时采集微生物标本作病原学检查2.2.在抗菌药物使用前采集标本在抗菌药物使用前采集标本3.3.采样时严格执行无菌操作采样时严格执行无菌操作4.4.采样后立即送检采样后立即送检5.5.棉拭子标本宜用运送培养基棉拭子标本宜用运送培养基6.6.混有正常菌群污染标本，不可置肉汤培养混有正常菌群污染标本，不可置肉汤培养7.7.标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂。标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂。8.8.送检标本应注明来源和检验目的送检标本应注明来源和检验目的临床标本的分类 带菌体液带菌体液 无菌体液无菌体液 痰 血液 咽拭子 脑脊液 关节腔积液 粪便 胸腹水 其他类别 其他类别尿液各类标本细菌培养的意义各类标本细菌培养的意义无菌体液（血、脑脊液、关节液、胸腹腔积液等）培养阳性的临床意义大，怀疑相应部位感染时应立即做细菌培养。各类标本细菌培养的意义各类标本细菌培养的意义痰培养痰培养引起咳嗽和咳痰的原因很多：病毒、支原体、引起咳嗽和咳痰的原因很多：病毒、支原体、衣原体、军团菌的感染；过敏、哮喘衣原体、军团菌的感染；过敏、哮喘 痰培养影响因素较多：痰培养影响因素较多：如白细胞吞噬、黏液包裹、定植菌污染建议：建议：1、培养意义不大，可以在经验治疗无效时考虑做细菌培养；2、停用抗生素3天后做培养；3、细菌培养同时做痰涂片镜检和血培养各类标本细菌培养的意义各类标本细菌培养的意义粪便培养粪便培养普通粪便培养仅筛选培养伤寒和痢疾，仅用于社区感染患者各类标本细菌培养的意义各类标本细菌培养的意义生殖道标本，一般不做普通细菌培养生殖道标本，一般不做普通细菌培养引起白带增多常见的原因：引起白带增多常见的原因：淋病、支原体、衣原体感染、细菌性阴道炎、滴虫、真菌性阴道病可以根据临床症状选择检查方法脓性白带：淋病奈瑟菌培养；稀薄、淡黄色、泡沫样白带：滴虫镜检外阴搔痒，豆腐渣样：镜检查真菌乳白色均质分泌物：BV（细菌性阴道炎）细菌培养的意义细菌培养的意义培养阳性感染排除污染排除定植任何结果都必须结合临床症状及其它相关检查进行综合分析细菌培养的意义细菌培养的意义培养阴性排除感染标本采集部位和方法是否在使用抗生素时留取的标本？标本运送时间和方法是否正确标本接种、培养基及培养方法的选择是否正确是否可能是厌氧菌或其它难培养的细菌感染药敏试验及与临床沟通药敏试验及与临床沟通临床抱怨：我们想用的药，试验中不包括；根据药敏试验进行治疗效果不好临床希望：实验室对临床所有常用的药物都进行药敏试验药敏试验的结果解释体外药敏试验是将细菌置于固定的药物浓度中测得，而药物在体内是一个不断被清除、被代谢的过程体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，体外耐药治疗无效；但体外敏感治疗有效。可以受多种因素影响影响抗生素治疗的因素影响抗生素治疗的因素l药物剂型及生物利用度（纯品、商品）l给药剂量和用药方式：时间依赖性、浓度依赖性，抗生素后效应l感染部位与药代动力学因素l特殊人群因素在治疗过程中很多细菌可以由原先的敏感变为耐药，随后临床出现可疑的耐药表现，需重复进行药敏试验。对一些耐药性容易改变的菌种应特别注意，如用三代头孢菌素治疗肠杆菌属、柠檬酸杆菌属和沙雷菌属所致感染；用喹诺酮类治疗葡萄球菌属所致感染以及用各种抗菌药物治疗铜绿假单胞菌所致感染的过程中都可能发生耐药。细菌诱导耐药与重复药敏试验何时重复分离细菌做药敏试验？何时重复分离细菌做药敏试验？CLSI M100-S17 3 3天内即可发展为耐药：天内即可发展为耐药：肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷菌属肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷菌属三代头孢三代头孢铜绿假单孢菌铜绿假单孢菌所有抗菌药物所有抗菌药物葡萄球菌属葡萄球菌属喹诺酮类喹诺酮类金葡金葡延长疗程可使万古霉素敏感株变为万古霉素延长疗程可使万古霉素敏感株变为万古霉素中介中介3-43-4天后，试验来自身体相似部位的重复分离菌天后，试验来自身体相似部位的重复分离菌对临床抱怨的解释对临床抱怨的解释对临床所有常用的药物都进行药敏试验没有必要，也没有可能根据CLSI建议选择的试验药物，已包括（或指示）治疗此类细菌感染所需抗生素的敏感性标志性抗生素的应用标志性抗生素的应用l根据敏感，判读敏感根据敏感，判读敏感：所有菌素对四环素敏感，表示对多西环素、米诺环素敏感l根据耐药，判断耐药根据耐药，判断耐药：葡萄球菌属细菌对苯唑西林/头孢西丁耐药，表示对所有-内酰胺类，包括酶抑制剂复合药和碳青霉烯类均耐药l根据敏感和耐药推测敏感和耐药根据敏感和耐药推测敏感和耐药：所有菌属对磺胺异恶唑敏感和耐药，表示对所有磺胺类敏感和耐药药敏试验中常用的试验药物及其代表的药物试验药物菌种可被推测的抗菌药物结果苯唑西林/头孢西丁耐药葡萄球菌属所有-内酰胺类，包括酶抑制剂复合药和碳青霉烯类均耐药四环素敏感所有菌属对多西环素、米诺环素敏感红霉素敏感和耐药链球菌属罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、地红霉素敏感和耐药氨苄西林敏感肠球菌属阿莫西林、哌拉西林及其与酶抑制剂的复合剂敏感氨苄西林敏感粪肠球菌亚胺培南敏感青霉素敏感葡萄球菌属、淋病奈瑟菌所有青霉素类、-内酰胺酶抑制剂复合物、头孢类、碳青霉烯类敏感青霉素敏感肠球菌氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦敏感氨苄西林敏感和耐药所有菌属阿莫西林、巴氨西林、氨环己西林、海他西林敏感和耐药磺胺异恶唑敏感和耐药所有菌属所有磺胺类敏感和耐药萘啶酸耐药肠杆菌科所有喹诺酮类耐药孢唑林敏感肠杆菌科所有头孢菌素敏感对临床所有常用的药物都进行药敏试验没有可能药敏试验必须遵照一定的方法，按照一定的规则判断，才能得到正确的结果，否则将是对临床治疗的误导有的药物在体外不稳定，不能进行药敏试验，如甲氧西林，不能用于耐甲氧西林葡萄球菌的检测有的细菌的药敏试验方法还在试验和研究中，暂时没有检测标准 医院获得性肺炎的病原治疗病原宜选药物可选药物甲氧西林敏感苯唑西林、氯唑西林第一代或第二代头孢菌素，林可霉素，克林菌素甲氧西林耐药万古霉素或去甲万古霉素磷霉素，利福平，复方磺胺甲噁唑与万古霉素或去甲万古霉素联合 细菌性脑膜炎的病原治疗病原宜选药物可选药物甲氧西林敏感苯唑西林万古霉素或去甲万古霉素(用于青霉素过敏患者)甲氧西林耐药万古霉素或去甲万古霉素+磷霉素万古霉素或去甲万古霉素+利福平一、血培养操作规范一、血培养操作规范 临床常见的采血指征体温（38C）或（36C）、寒战心率90次/分，呼吸频率20次/分WBC增多（计数12109/L）WBC减少（计数4109/L）血小板减少 皮肤粘膜出血 昏迷，休克多器官衰竭 CRP/PCT升高皮肤消毒程序，严格执行三步法:1、用75%酒精擦拭静脉穿刺部位待30s以上 2、用1%-2%碘酊作用30s或10%碘伏作用60s，从穿刺点向外画圈消毒,至消毒区域直径达3cm以上，涂擦穿刺皮肤2遍，待干燥。3、75%酒精脱碘：用75%酒精由内向外方向涂抹去碘酒液，待酒精挥发干燥后采血。培养瓶消毒程序*打开血培养瓶塑料盖用75%酒精消毒血培养瓶 橡皮塞并擦干表面残余酒精*消毒皮肤后用无菌注射器抽取血液从橡皮塞处注入血培养瓶内*用75%酒精重新消毒血培养瓶橡皮塞并盖好塑料盖*立即送检。血培养标本的运送采集后的血培养瓶应在1小时之内送往实验室。血培养瓶在采血接种后在室温不超过数小时。血培养瓶在接种前和接种后均不得冷藏或冷冻。采血量采血量 成人为成人为810 ml,儿童儿童15 ml 有人引述多篇文章指出有人引述多篇文章指出:对成人每增加对成人每增加1ml 1ml 血量血量平均能提高阳性率平均能提高阳性率3.2%3.2%。采血份数和采血时机采血培养应该在使用抗生素之前进行间歇性寒战或发热应在寒战或体温高峰到来之前0.5小时采集血液，不知发热规律应在寒战或发热后半小时后进行。（研究表明细菌常在寒战或发热前1h入血，此时采血培养最佳。）24h内采2-3份血培养，至少做到“双侧双瓶”。持续性菌血症：如急性心内膜炎、导管相关sepsis时需多次取血监测，特别是金葡菌时。血培养采血量、份数与阳性率 研究表明，当每套血培养采血20ml时一套检出率：65%二套检出率：80%三套检出率：96%目前的指南推荐采集23套血培养 特殊的全身性和局部感染患者采血培养的建议(1)可疑急性原发性菌血症、真菌菌血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎或肺炎,应在不同部位采集2 3 份血标本。(2)不明原因发热,如隐性脓肿,伤寒热和波浪热,先采集2 3 份血标本,24 36 h 后估计体温升高之前(通常在下午)再采集2 份以上。特殊的全身性和局部感染患者采血培养的建议(3)可疑菌血症或真菌菌血症但血培养持续阴性,应改变血培养方法,以获得罕见的或苛养的微生物。(4)可疑细菌性心内膜炎,在1 2 h 内采集3 份血标本,如果24 h 后阴性,再采集3 份以上的血标本。采集部位推荐从外周静脉采集血液标本。不推荐动脉血，因其诊断价值没有比静脉血更大。不推荐静脉留置导管，因其常伴有高污染率。如果必须从留置导管内采血，也应同时从外周静脉采集另外一个血培养标本以帮助阳性结果的判读提供解释。血液细菌培养合格的操作1 从静脉取血2 不宜从静脉导管或静脉留置口取血3 若从导管设施取血，须同时静脉取血，以求对比和解释，不要弃去初段血，不要用抗凝剂冲洗4 不推荐静脉血直接入瓶，不要和测血气及血沉的取血同时进行（或在先）5 不主张换针头入瓶6 有血的培养瓶不可放入冰箱和冻箱保存 7 建议至少一次做两瓶培养，一瓶需氧一瓶厌氧瓶数及血量瓶数及血量结论1：绝对不能只用一瓶寒战升温之间应采血20毫升分装两个瓶内先分配在需氧瓶10ml，然后剩余的入厌氧瓶内，因为真菌、绿脓杆菌、窄食单胞菌只长在需氧瓶内。结论2：2-5天内不必重复取血结论3：只有可疑为持续性菌血症：如心内膜炎、导管相关sepsis时，才要有间隔地(1h至24h)几次取血监测、捕捉、指导治疗；特别是金葡菌时。血培养假阳性的危害血培养假阳性的危害1 1、增加患者抗生素用量，破坏其微生态环境、增加患者抗生素用量，破坏其微生态环境2 2、延长了住院天数、延长了住院天数3 3、延误病情诊断、延误病情诊断4 4、增加经济负担、增加经济负担二、泌尿标本采集的规范尿液培养标本送检指征1 有典型的尿路感染症状；2 肉眼脓尿或血尿；3 尿常规检查表现为白细胞和/或亚硝酸盐阳性；4 不明原因的发热，无其他局部症状；5 留置导尿管的病人出现发热；6 膀胱排空功能受损；7 泌尿系统疾病手术前。您知道吗？正常人尿液是无菌的，而尿液细菌培养最大的问题是杂菌污染。正常人外尿道有大肠杆菌、葡萄球菌等存在。而这些细菌又是尿路感染中常见的病源菌。因此要作好尿液细菌学检查，首先应注意标本收集问题。尿培养样本采集方法 标本采集应力争在未使用抗生素之前注意避免消毒剂污标本采集应力争在未使用抗生素之前注意避免消毒剂污染标本染标本 1 清洁外阴部，留取中段尿（晨尿最佳）约10 20ml直接排入专用的无菌容器中，立即送检，2h内接种。2 耻骨上膀胱穿刺：评估膀胱内细菌感染的“金标准”方法。3 直接导尿：可减污染，准确反映膀胱感染情况。4 小儿收集包：对于无控制能力的小儿可应用收集包收集尿液，这种装置由于很难避免会阴部菌群污染产生假阳性，所以只有在检验结果为阴性时才有意义。5 留置导尿管收集尿液：穿刺导尿管吸取尿液，不能从收集袋中采集尿液。长期留置导尿患者，应在更换新尿管时留取尿标本。泌尿标本采集的规范 1、采集后的标本应立即送检。标本采集后应立即送检，否则可暂存于4冰箱。2、采集时间：多数药物从尿道排泄，所以不管用哪种方法都应在用药前采集。应采集早晨第一次的尿。3、标本管不应含防腐剂和消毒剂。4、采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器包括包皮内，然后用清水冲洗。5、长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本。6、做厌氧培养时应膀胱穿刺采集尿。特别注意尿液通常是无菌的或一过性有少量微生物，但是尿道内尿液通常是无菌的或一过性有少量微生物，但是尿道内或尿道周围皮肤的菌群会污染尿液标本，从而可能导致或尿道周围皮肤的菌群会污染尿液标本，从而可能导致错误的培养结果。错误的培养结果。诊断症状明显的病人（如尿急、尿频、尿痛），一份标诊断症状明显的病人（如尿急、尿频、尿痛），一份标本就已足够，治疗本就已足够，治疗48 48 7272小时后再采集第二份标本。小时后再采集第二份标本。对于症状不明显的病人，需采集对于症状不明显的病人，需采集2 2 3 3份标本。份标本。特别注意多次收集或多次收集或2424小时尿不能用作培养。小时尿不能用作培养。室温都有利于病原菌和污染菌会生长繁殖，因室温都有利于病原菌和污染菌会生长繁殖，因此若此若30min30min内不能及时培养尿液则必须冷藏，内不能及时培养尿液则必须冷藏，但也不能超过但也不能超过2424小时。小时。特别注意 多数药物从尿道排泄,所以标本采集应力争在未使用抗生素之前或停用抗菌药5d之后留取尿液标本;尿液在膀胱内应停留6 8h以上，使细菌有足够的时间繁殖,故应尽量采集早晨第一次的尿,同时注意避免消毒剂污染标本。三、下呼吸道分泌物（痰培养）标本采取规范下呼吸道标本标本送检指征1 咳嗽、咳痰：痰液可为脓性、血性、铁锈色或红棕色胶胨样痰。2 咯血：肺结核病人常痰中带血。3 呼吸困难4 发热5 胸痛：当炎症病变累及壁层胸膜时，会发生胸痛。肺部感染的患者有25 50可能发生菌血症，应同时作血培养。病原体种类繁多而复杂使下呼吸道感染病原诊断成为难题使下呼吸道感染病原诊断成为难题细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）真菌（包括肺孢子菌）真菌（包括肺孢子菌病毒病毒支原体、衣原体与立克次体支原体、衣原体与立克次体原虫原虫寄生虫寄生虫咳痰途经口咽部唾液中口咽部定植菌的浓度可达108 109/ml。研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。不可避免地受到污染不可避免地受到污染我国痰细菌培养现状标本送检率低苛养菌检出率极低结果重复性差报告速度慢感染菌与污染菌不易区分药敏结果与治疗反应存在差距咳痰标本的采集标本采集方法标本采集方法医师或护士直视下采集标本医师或护士直视下采集标本病人先漱口，去除表面的菌群病人先漱口，去除表面的菌群教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液临床上约半数咳痰标本不合格！临床上约半数咳痰标本不合格！关于咳痰标本在抗生素应用前采集痰标本在抗生素应用前采集痰标本;标本采集后标本采集后1 1 2h2h内必须立即进行实验室处理；内必须立即进行实验室处理；咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本咳痰标本应用最早且广泛，但也是最受争议的标本 ;取标本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口取标本前应摘去牙托，清洁口腔如刷牙和漱口;深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导深咳，采集标本过程中要有专业的医务人员指导;无痰可用无痰可用3 3 5 5NaCl 5mlNaCl 5ml雾吸约雾吸约5min5min导痰；导痰；也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰；也可用物理疗法、体位引流鼻导管抽吸等法取痰；下呼吸道标本采集方法1 自然咳痰法：晨痰、漱口，深咳呼吸道深部痰（非后鼻部分泌物、非唾液）留于无菌容器内。对于痰量少或无痰的患者可采用雾化吸入4510NaCL 水溶液，使痰液易于排出。对咳痰少的幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽。2 支气管镜采集法：经支气管镜直接吸引经支气管镜直接吸引支气管肺泡灌洗支气管肺泡灌洗防污染样本毛刷防污染样本毛刷痰培养的送检次数对于普通细菌性肺炎，对于普通细菌性肺炎，痰标本送检每天痰标本送检每天1 1次，连续次，连续2 2 3 3天。天。不建议不建议24h24h内多次采集，除非痰液外观性状内多次采集，除非痰液外观性状出现改变；出现改变；痰培养的运送和保存所有病人的下呼吸道标本应在采集后立即送至微生物室，并于1小时内接种如不能及时送达，应将标本暂存于4，但放置时间不可超过24h。被口咽部菌群污染的标本如咳痰等不可用于厌氧菌培养。室温下放置1h会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的分离率而定植于上呼吸道的非致病菌则会过度生长四、生殖道标本采集规范生殖道标本的采集方法推荐使用男性或女性专用拭子。男性前列腺：用肥皂和水清洗阴茎头，通过直肠按摩前列腺，用无菌拭子收集液体或使液体进入无菌管内。男性尿道：用泌尿生殖道拭子插入尿道腔2 4cm，旋转拭子，至少停留20s，而使之容易吸收。生殖道标本的采集方法女性阴道：擦除过多的分泌物和排出液，用2支无菌拭子从阴道穹隆部黏膜处获取分泌物。1支需要涂片,1支拭子做培养。女性尿道：患者排尿1h后采集，拭去尿道口的渗出物，用拭子通过阴道，靠着耻骨联合，按摩尿道，采集尿液。宫颈：用无润滑剂的扩阴器使宫颈可见，用拭子从宫颈上拭去黏液和分泌物，丢掉拭子，用新的无菌拭子紧帖宫颈内道轻轻采样。后穹窿：送抽吸液。五、其他无菌体液的采集运送规范其他无菌体液的采集运送规范1无菌采集是培养成功的首要因素2采集的标本应立即送至临床细菌室，脑膜炎球菌有自溶酶，离体后回迅速自溶。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌离体后极易死亡。3延迟送检时一定不能放冰箱，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等对温度敏感的细菌在冰箱会很快死亡。