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1.基因工程的定义:
(1).将外源基因经过体外重组后导入受体细胞内, 使这个基因能在受体细胞内复制、 转录、 翻译表示的操作称为基因工程
基因工程包括基因的分离、 重组、 转移以及基因在受体细胞内的保持、 转录、 翻译表示等全过程。
(2).基因工程( genetic engineering) 也叫基因操作、 遗传工程, 或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、 质粒或其它载体分子, 构成遗传物质的新组合, 并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内, 而能持续稳定的繁殖。

2.基因工程的实施至少要有四个必要条件:工具酶,基因,载体,受体细胞

3一般认为1973年是基因工程诞生的元年( S. Cohen等获得了卡那霉素和四环素双抗性的转化子菌落)理论上的三大发现和技术上的三大创造对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。

4. 理论上的三大发现
( 1) 、 DNA是遗传物质被证实1944年, Avery O.T.利用肺炎双球菌转化实验
( 2) 、 DNA的双螺旋结构和半保留复制机理
( 3) 、 ”中心法则”和”操纵子学说”的提出三联体密码子系统的建立
5,限制性内切酶(restriction endonuclease)这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶
识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
限制性核酸内切酶的发现:
限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶, 其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染, 是细胞中的一种防御机制。

II型限制性核酸内切酶的基本特性:
a. 识别位点的特异性识别靶序列是唯一的, 一般是由4～8个核苷酸组成的特定序列( 靶序列) 。
b. 识别序列的对称性 靶序列一般具有双重旋转对称的结构, 以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称, 重复排列切割序列呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome)
c. 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
d. 核酸内切酶作用后的断裂方式
粘性末端 : 两条链上的断裂位置是交错地、 但又是围绕着一个对称结构中心, 这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。
平末端: 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。
6,.星号活性:在”非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生”松动”, 从其”正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子, 这种现象叫星号活性。用*表示。
7. 连接酶的来源
1. DNA连接酶: 大肠杆菌染色体编码的
2. T4 DNA连接酶: 大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的

DNA连接酶 －－NAD+
T4 DNA连接酶 －－ATP
8. 体外连接的三种方式:
1. 用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断
2. 用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接; 或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)- poly(T)尾巴之后, 再用ＤＮＡ连接酶连接。
3. 先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头, 形成粘性末端后, 再用ＤＮＡ连接酶连接.
9. ＤＮＡ连接酶:
能够将DNA链上彼此相邻的3’羟基( OH ) 和5’-磷酸基团( -P) , 在NAD+或ATP供能的作用下, 形成磷酸二酯键。
只能连接缺口( nick) , 不能连接裂口( gap) 。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。
限制片断的末端连接作用
分子间的连接: 不同的DNA片断经过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。
分子内的连接: 由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。
Ｔ４ＤＮＡ连接酶( DNA ligase)
该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取, 是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的, 因此基因工程中常见的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成, 从而使两个片段以共价键的形式结合起来。
DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接, 对平末端的DNA分子也能够进行连接, 但连接效率较低, 必须加大酶的用量。
影响连接酶作用的因素
1. 反应温度:
连接缺口的温度: 37度
连接粘性末端的最佳温度: 4～15度
2.Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量:
平末端DNA分子的连接反应中, 最适1～2个单位。
粘性末端DNA片断之间的连接, 酶浓度0.1个单位。
ATP的用量10μmol~1mmol/L之间
3. 提高外源片断与载体的浓度的比值, ( 10～20倍)
10.合成cDNA的主要步骤:
1、 应用poly(A)mRNA为模板, 以12~18个碱基长的oligo(dT)片断作为引物, 加入反转录酶, 合成出cDNA第一链;
2、 用碱水解法除去mRNA模板, 单链cDNA能自我折叠形成一种发夹结构, 作第二链的引物, 用反转录酶或Klenow聚合酶催化第二链cDNA的合成;
3、 用SＩ核酸内切酶消化除去单链区的发夹结构。
4、 经过同聚物或合成的衔接物, 使DNA分子克隆到适当的载体分子上。
11.同裂酶( isoschizomers) 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割, 产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。
Example:
限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) , 当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割, 而MspⅠ能够。
同尾酶( isocaudamer) 指来源不同、 识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。
12.注 意: 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接, 可是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。
13. DNA的甲基化程度
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基, 受其影响的酶有Bcl I、 MboI等, 但BamH I、 Bgl II、 Sau3A I不受影响 .

14.基因克隆: 经无性繁殖获得基因许多相同基因拷贝的过程
15基因工程的基本操作步骤:
• 1、 目的基因的取得
• 2、 载体的选择
• 3、 目的基因与载体DNA的体外重组
• 4、 重组载体引入受体细胞
• 5、 表示筛选
16.基因文库(gene library) 指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外经过重组后, 转化宿主细胞, 并经过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落( 或噬菌体) , 所有菌落或噬菌体的集合。按照外源 DNA 片段的来源, 可将基因文库分为:
• 基因组文库(genomic library) ( 含有全部基因)
• cDNA文库(complementary DNA library) ( 含有全部蛋白质编码的结构基因)
17. 1.基因组 DNA 文库: 指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段, 与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。
2、 目的:
a) 分离有用的目的基因
b) 保存某种生物的全部基因

18. 相对于cDNA文库, 基因组文库的优点:
§ cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构, 没有包括基因组的间隔序列。
§ cDNA文库中, 不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态, 即: 高丰度mRNA的cDNA克隆, 所占比例较高, 分离基因容易; 低丰度mRNA的cDNA克隆, 所占比例较低, 分离基因困难;
§ 从cDNA克隆中, 不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段的序列, 不能用于研究基因编码区外侧的调控序列的结构与功能。
19. 基因组文库的构建流程:
• ① 载体的选择和制备;
• ② 高纯度、 大分子量基因组 DNA 的提取;
• ③ 基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;
• ④ 载体与DNA片段的连接;
• ⑤ 转化或侵染宿主细胞。
20. cDNA文库的构建流程:
• ① 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离;
② 第一链 cDNA 合成;
③ 第二链 cDNA 合成;
④ 双链 cDNA 克隆到载体并导入宿主细胞中繁殖。
21.报告基因: 是指其编码产物能够被快速测定、 常见于判断外源基因是否成功地导入受体细胞( 器官或组织) 、 是否启动表示的一类特殊用途的基因。
报告基因: 报告和识别作用, 它的表示产物对植物无毒性, 它反映外源基因在植物细胞中的翻译水平。如: 细菌和萤火虫的荧光素酶; 绿色荧光蛋白
22.脱分化: 是离体培养条件下生长的细胞、 组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞的过程。
23.植物基因工程的定义:
利用基因工程技术, 在离体条件下对生物的DNA进行加工, 并按照人们的意愿和适当的载体重新组合, 再将重组DNA转入植物体或细胞内, 并使其在植物细胞中表示, 从而生产不同的产物或定向创造生物的新性状, 并能稳定的遗传给下代
载体
载体( vector) 是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分, 经过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面, 而进行复制.
1、 载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力
为外源基因的扩增或表示提供必要的条件
克隆载体:
克隆一个基因或DNA片断
表示载体:
用于一个基因的蛋白表示
整合载体:
把一个基因插入到染色体组中
克隆载体的特点
1.作为基因克隆的载体必须具备以下特性:
⑴至少有一个复制起点
⑵至少应有一个遗传标记基因, 以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞
⑶具备多克隆位点( MCS) , 便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小, 拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
β—半乳糖苷酶基因的优点:
a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物, 检测直观
b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性
c. lacZα和β链基因的分别表示可使载体小而容量大
质粒载体
生物学特性: (1)是染色质外的双链共价闭合环形DNA (少数为线形和RNA)
(2) 能自主复制, 是能独立复制的复制子 (3)质粒的生存 ( 4) 质粒的不相容性
（5） 质粒的转移     ( 6) 携带特殊的遗传标记
质粒载体必须具备的基本条件
一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件:
(i)具有复制起点
(ii)具有抗菌素抗生基因
( iii) 具若干限制酶单一识别位点
( iv) 具有较小的分子量和较高的拷贝数
 质粒载体不稳定性的类型
结构的不稳定性: 主要指由转位和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失。
分离的不稳定性: 在细胞分裂过程中, 有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝, 并最终增值成为无质粒的优势群体。
结构的不稳定性
DNA的缺失、 插入和重排是造成质粒载体结构不稳定性的原因。
1、 质粒的自发缺失: 同向重复短序列之间的同源重组。
2、 寄主染色体及质粒载体上的IS因子或转位因子也会引起结构的不稳定性。
分离的不稳定性
细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配, 寄主细胞分裂时一个细胞没有获得质粒拷贝, 并最终繁殖为优势群体。
要使质粒能够稳定的遗传, 必须保证
( 1) 每个世代, 每个质粒最少复制一次;
( 2) 细胞分裂过程中, 质粒复制的拷贝必须分配 到两个子细胞中去。
影响质粒载体稳定性的主要因素:
1、 新陈代谢负荷
2、 拷贝数差度
3、 寄主重组体系
噬菌体载体
噬菌体的一般生物特性
可脱离寄主细胞生存, 但不能进行复制。
除了对寄主的依赖性 还具备其它的功能:
1、 保护自己的核苷酸分子( DNA、 RNA) 免遭环境化学物质的破坏;
2、 将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞;
3、 将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系, 从而长生出大量的子代噬菌体颗粒;
4、 使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒
溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化, 然后进行自我复制、 蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装, 最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。
1. λ噬菌体的生物学特性
(1)是一个温和噬菌体
一般以溶源生长进行增殖, 胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。
溶原保存, 而且在一定条件下又可转入溶菌生长途径, 进行大量增殖。
λ噬菌体的特征:
1、 噬菌体的DNA分子注入细菌细胞
2、 经过短暂的转录之后, 需要合成一种整合酶, 于是转录活性便被一种阻遏物所关闭
3、 噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上, 变成原噬菌体
4、 细菌继续生长、 增值, 噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。
(2)复制
溶源周期随溶源细菌染色体一起复制
溶菌周期的早期是”θ”复制, 晚期进行滚环复制
λ噬菌体的优点:
比一般的质粒载体容量大的多, 一般用于真核生物基因组文库的建立
M13噬菌体
1、 单链噬菌体的生物学特性
⑴+DNA, 是单链闭合环状噬菌体
⑵复制型( RF) 是双链环状DNA为中间媒介
（3） RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。并产生噬菌斑。
( 4) 不存在包装限制( 噬菌体颗粒大小, 是受DNA大小制约)
( 5) 可产生大量的含有外源DNA插入片段的单链分子, 便于作探针或测序
1.生物学特性
( 1) 寄主
M13噬菌体颗粒只感染E.coli 的F+细胞
（2） 外形成丝状
（3） DNA提纯, M13DNA(RF)在寄主菌内是高拷贝双链环状分子和游离的单链的正( +) 链DNA, 象质粒一样自主制复
（4） M14的生活周期, 虽然不导致溶菌, 但使菌斑浑浊
( 5) 没有包装限制
3. M13优缺点
M13mp载体系列, 特别适用于克 隆单链的DNA分子。它的优点:
第一, 在这类载体的基因组中有一条被修饰的β-半乳糖苷酶基因片段, 其中插入了一段具有密 集的多克隆位点的序列
第二, M13载体系列能够有效地克隆双链DNA分子中的每一条单链。
M13载体的缺点
插入外源DNA后, 遗传稳定性显著下降
实际克隆能力小于1500bp。
粘粒载体( cosmid vectors)
粘粒载体是一类人工构建的含有lDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体
cosmid vector 的特点
①具有λ噬菌体的特性
提供了体外包装必须的cos位点。因此克隆外源DNA后能够体外包装成λ噬菌体颗粒。可是由于cosmid vector 不含有λ噬菌体溶菌, 溶源生长途径和DNA复制系统, 因此不会产生子代噬菌体
②具有质粒载体的特性:大多带有pMB1或COlE的复制子, 能像质粒一样复制, 具有转化大肠杆菌的功能, 还有一些克隆位点。
③方便的选择: 有抗菌素抗性基因, 和插入失活的克隆位点。
④高容量的克隆能力
cosmid cloning
应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片段的真核基因组DNA技术, 叫cosmid cloning
①理论依据:
Cos位点: 包装识别
多联体复制: 噬菌体的生命周期中, 会产生数百个DNA经过cos位点连接的多联体分子
Ter体系: 在包装的时候, 噬菌体具有位点特异的末端酶( terminase) 体系( Ter体系) , 识别cos位点, 把多联体切成单个DNA长度。
包装限制: 两个cos位点之间, 必须保持38-45kb的DNA, Ter体系才能识别。
Cosmid克隆的一般过程
①用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA
②用同样的内切酶消化cosmid载体
③连接:产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos位点, 长度40kb的真核DNA与载体的连接物。
④Ter体系识别并切割:切割合适长度的杂种DNA连接物, 并包装入噬菌体头部
⑤感染大肠杆菌:注入到细菌体内的杂种DNA分子环化, 并按质粒的方式复制。
Cosmid载体克隆的缺点
不如λ噬菌体载体。
①载体片断自我连接
②外源DNA片断自我连接
③多个原来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体
克服载体自体连接的改良方案
用碱性磷酸酶除去线性质粒片断5’端的磷酸, 可防止载体自体连接。
④细菌的菌落体积远大于噬菌斑, 筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法, 但由于cos质粒制成的基因文库常常不太稳定, 插入的大片段外源DNA有可能经过同宿主基因组交换而致丢失等, 因此最常使用的还是噬菌体载体

人工染色体载体
人工染色体指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统
人工染色体克隆载体实际上是一种”穿梭”克隆载体, 含有质粒克隆载体所必备的第一受体( 大肠杆菌) 源质粒复制起始位点( ori) , 含有第二受体( 酵母) 染色体DNA着丝点、 端粒和复制起始位点的序列, 以及合适的选择标记基因。这样的载体在第一受体细胞内能够按质粒形式进行高拷贝复制。
天然染色体基本功能单位包括复制起始点(replication origin)、 着丝粒(centro    mere)和端粒(telomere)。复制起始点, 保证了染色体复制, 着丝粒保证了染色体分离, 端粒封闭了染色体末端, 防止粘附到其它断裂端, 保证了染色体的稳定存在
酵母人工染色体( yeast artificial chromosome,YAC)
 在 YAC 载体中最常见的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的, 因此其在工作状态也是线状的。可是, 为了方便制备YAC载体, YAC 载体以环状的方式存在, 并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记, 以便保存和增殖。
YAC的特点
(1)只能在酵母细胞中扩增
(2)克隆容量大, 为230kb-1700kb
(3)构建原理, 按染色体结构构建
染色体复制和遗传的三个基本组件
YAC 载体的复制元件是其核心组成成分, 其在酵母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序列( autonomously replicating sequence, ARS) 、 用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 ( centromere , CEN) 和两个端粒( TEL)
优点 : 能够容纳更长的DNA片段, 用较少的克隆就能够包含特定的基因组全部序列, 从而保 持了基因组特定序列的完整性, 有利于物理图谱的制作。
缺点 : ( 1) 克隆外源基因易出现嵌合体。
　　( 2) 有些克隆不稳定。
　　( 3) YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离。
表示载体
该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的, 主要增添了强启动子, 以及有利于表示产物分泌、 分离或纯化的元件。表示载体( Expression vectors) 就是在克隆载体基本骨架的基表示载体必备元件
表示载体除了要具有克隆载体的基本元件( ori,Ampr,Mcs等) 还具有转录/翻译所必须的 强启动子、 核糖体结合位点、 转录起始信号、 转录终止子、 翻译起始密码子、 终止密码子等一序列调控序列。表示载体不但能使外源基因扩增, 还能使其表示。
启动子: 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。
最佳启动子具备的条件 :第一 必须是强启动子, 能够克隆基因的蛋白质产物的表示量占细胞总蛋白的10%-30%以上;第二 、 应能呈现低水平的基础转录, 便于表示毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质, 使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件;第三 应是诱导型的, 用温度或化学试剂来诱导表示。( IPTG)
乳糖启动子Plac的可控性:
野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起, 在没有诱导物存在时, 整个操纵子处于基底水平表示; 诱导物能够使启动子Plac介导的转录大幅提高
2.翻译的起始位点
( 1) 核糖体结合位点( RBS) ribosome binding site
Shine-Dalgarno (SD) sequence
（2） 起始密码子, 位于SD下游
( 3) 转录终止子: 源基因起始转录后, 保持mRNA的有效延伸、 终止及稳定存在是外源基因有效表示的关键。
( 4) 翻译终止子: 大肠杆菌偏爱使用终止子UAAU, 一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃
( 5) 翻译增强子: 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表示效率。
原核表示载体
非融合型表示载体
载体表示出的外源基因蛋白不与细菌的任何蛋白质融合在一起。
优点: 产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。
缺点: 容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。
rrnB:终止子

tac:启动子
Ampr:氨苄抗性基因
Tetr:四环素抗性基因
pBR322:来源于pBR322载体的基因
S-D :插入位点区
Ori:起始位点
lacO:调节基因

lac 启动子、 信号肽序列: 蛋白质 A 的信号肽序列两个合成的 Z 功能域来自金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 的蛋白质 A 具有与抗体 IgG 结合的能力, Z 功能域就是根据蛋白质 A 中结合 IgG 的 B 功能域而设计的。融合蛋白表示后, 在信号肽序列的指导下, 分泌到培养基中。然后用固定了 IgG 的琼脂糖层析柱, 经过与 ZZ 功能域的结合而得到纯化的融合蛋白。这个 14kDa 的 ”ZZ” 肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没有影响。