京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏限度操作的方案.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏的限度操作方案,一、试验材料,1,、供试品,：,150ml/,瓶 京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏,成份,川贝母、枇杷叶、南沙参、茯苓、化橘红、桔梗、法半夏、五味子、瓜蒌子、款冬花、远志、苦杏仁、生姜、甘草、杏仁水、薄荷脑，辅料为：蜂蜜、麦芽糖、糖浆。,性状,本品为棕褐色稠厚的半流体；具杏仁香气，味甜，辛凉。,功能主治,润肺化痰、止咳平喘、护喉利咽、生津补气、调心降火。本品适用于伤风咳嗽、痰稠、痰多气喘、咽喉干痒及声音嘶哑。,包装,玻璃瓶装，每瓶装,150,毫升。,2,、培养基,：培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。,以下是本试验中要用到的培养基：,1),营养肉汤培养基,2),硫乙醇酸盐流体培养基,3),改良马丁培养基,4),玫瑰红钠琼脂培养基,5),酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（,YPD,）,6),胆盐乳糖培养基（,BL,）,7),乳糖胆盐发酵培养基,8),曙红亚甲蓝琼脂培养基（,EMB,）,9)8.4-,甲基伞形酮葡糖苷酸（,MUG,）,10),三糖铁琼脂培养基（,TSI,）,11,）四硫磺酸钠亮绿培养基（,TTB,）,12,）溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基,13,）亚碲硫酸盐肉汤培养基,14,）卵黄氯化钠琼脂培养基,15,）乳糖发酵培养基,16,）胆盐硫乳琼脂培养基,(DHL),17,）绿脓菌素（,Pyocyanin,）测定用培养基（,PDP,琼脂培养基）,18,）梭菌增值培养基,19,）哥伦比亚琼脂培养基,20,）,4%,沙氏葡萄糖液体培养基,21,）,1%,沙氏葡萄糖液体培养基,22,）沙氏葡萄糖琼脂培养基,23,）念珠菌显色培养基（,CHROMagar,）,24,）,1%,吐温,80-,玉米琼脂培养基,3,、试剂,：,（,1,）试液,二盐酸二甲基对苯二胺 取二盐酸二甲基对苯二胺,0.1g,，加水,10ml,，即得。需新鲜少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。,亚碲酸钠（钾）试液 取亚碲酸钠（钾）,0.1g,，加新鲜煮沸后冷至,50,的水,10ml,是溶解。,玫瑰红钠试液 取玫瑰红钠,0.1g,，加水使溶解成,75ml,。,亮绿试液 取亮绿,0.1g,，加水,100ml,使溶解。,盐酸试液 取盐酸,8.4ml,，加水使稀释成,100ml,。,靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛,5.0g,，加水戊醇（或丁醇）,75ml,，充分振摇，使完全溶解后，在取浓盐酸,25ml,徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，或去对二甲氨基苯甲醛,1.0g,，加入,95%,乙醇,95ml,，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸,20ml,徐徐滴入。,碘试液 取碘,6g,于碘化钾,5g加水,20ml,使溶解。,过氧化氢试液 取浓过氧化氢溶液（,30%,），加水稀释成,3%,的溶液。临用时配制。,（,2,）试药,十四烷酸异丙脂,Isopropy Myristate【CI7H34O2=270.46】,本品为无色液体。溶于乙醇、乙醚、丙酮、三氯甲烷或甲苯，不溶于水、甘油或丙二醇。约,280,分解。,二盐酸二甲基对苯二胺,N,，,N-dimethyl-p-phenylenediaminedihydrochloride【C8H12N2,2HCL=209.12】,本品为白色或灰白色结晶性粉末；指控其中色渐变暗；易吸潮。在水或乙醇中溶解。,溴化十六烷基三甲胺,Cetyl Trimethymmonium Bromide【C19H42BrN=364.46】,本品为白色结晶。在水中溶解，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。,中性红,Neutral Red【C15H17N4Cl=288.78】,本品为深绿色或棕黑色粉末。在水或乙醇中溶解。,牛肉浸出粉,Beef Extracat Powder,本品为米黄色粉末，在水中溶解。,牛胆盐,Ox Bile Salt,本品为淡黄色或黄棕色粉末，味苦而甜，具吸湿性。在水或 醇中易溶。,甘露醇,Mannitol【C6H14O6=182.17】,本品为白色结晶；无臭，味。在水中溶解，在乙醇中微溶。,4-,甲基伞形酮葡糖苷酸,4-Methylumbelliferyl-D-glucuronide,，,MUG【C18H16O9=376.3】,本品为白色针状结晶。在水、乙醇或乙醚中溶解。在喜庆氧化钠溶液中分解。,去氧胆酸钠,Sodium Deoxycholate【C24H39NaO4=414.56】,本品为白色结晶性粉末，味苦。易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。,亚碲酸钠,Sodium Tellurite【Na2TeO3=221.58】,本品为白色粉末。在热水中易溶，在水中微溶。,玫瑰红钠（四氯四碘荧光素钠）,Rose Bengal Sodium Salt【C20H2CL4I4Na2O5=1017.6】,本品为棕红色粉末，在水中溶解，溶液中呈紫色，无荧光在硫酸中溶解，溶液为棕色。,单硬脂酸甘油酯,Glycerol Monostearte【C12H42O4=358.556】,本品为白色或黄色蜡状。在热有机溶剂或矿物油中溶解，在水中不溶，但与水能乳化。,枸橼酸钠,Sodiu Citrate【C6H5Na3O7,2H2O】,本品为白色结晶或粉末。在水中易溶，在乙醇中不溶。,枸橼酸铁按,Ammonium Ferric Citrate【C12H22FeN3O14=488.16】,本品为棕红色或绿色鳞片或粉末，易潮解，见光易还原成亚铁。在水中溶解，在醇或醚中不溶。,胰蛋白胨,Tryptone,本品为米黄色粉末。在水中溶解。,硫酸锌,Zinc Sulfate【ZnSO4,7H2O=287.56】,本品为白色结晶、颗粒或粉末。在水中易溶，在甘油中溶解，在乙醇中微溶。,硫酸锰,Manganese Sulfate【MnSO4,H2O=169.02】,本品为粉红色结晶。在水中溶解，在乙醇中不溶。,酪蛋白胰酶消化物（胰酪胨或酪胨）,Pancreatic Digest of Casein,本品为黄色或浅黄色颗粒。以干酪素为原料经胰酶水解、活性炭脱色处理、精致而成。,（,3,）指示剂,中性红指示剂 取中性红,1.0g,，研细，加,95%,乙醇,60ml,使溶解，加水至,100ml,。,变色范围,pH6.88.0,（红黄）。,亚甲基蓝指示剂 取亚甲蓝,0.5g,，加水使溶解成,100ml,。,酚磺酞指示剂 取酚磺酞,1.0g,，加,1mol/L,氢氧化钠溶液,2.82ml,，使溶解，再加水至,100ml,。,变色范围,pH6.88.4,（黄红）。,溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫,1.6g,，加,95%,乙醇使溶解成,100ml,。,变色范围,pH5.26.8,（黄紫）。,曙红钠指示液 取曙红钠,2.0g,，加水使溶解成,100ml,。,4,、菌种,：,大肠埃希菌（,Escherichia coli,）,CMCC,（,B,）,44 102,金黄色葡萄球菌（,Staphylococcus aureus,）,CMCC,（,B,）,26 003,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,）,CMCC,（,B,）,63 501,白色念珠菌（,Candida albicans,）,CMCC,（,F,）,98 001,黑曲霉（,Aspergillus niger,）,CMCC,（,F,）,98 003,乙型副伤寒沙门菌（,Salmonella paratyphi,B,）,CMCC,（,B,）,50 094,铜绿假单胞菌（,Pseudomonas aeruginosa,）,CMCC,（,B,）,10 104,生孢梭菌（,Clostridium sporogenes,）,CMCC,（,B,）,64 941,二、操作方法,1,、供试液的制备,供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过,1,小时。,供试品,40ml,，取,20ml,加,pH7.0,无菌氯化钠,-,蛋白胨缓冲液至,200ml,，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为,110,的供试液；取,1,：,10,的供试液,10ml,用,pH7.0,无菌氯化钠,-,蛋白胨缓冲液稀释至,100ml,，混匀，作为,1,：,100,的供试液；取,1,：,100,的供试液,10ml,用,pH7.0,无菌氯化钠,-,蛋白胨缓冲液稀释至,100ml,，混匀，作为,1,：,1000,的供试液。其余,20ml,供试品直接用于沙门菌的检验。必要时加适量的无菌聚山梨酯,80,，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。,2,、细菌、霉菌及酵母菌计数,（,1,）计数培养基的适用性检查：细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查。,菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养,18,24,小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养,24,48,小时。上述培养物用,0.9%,无菌氯化钠溶液制成每,1ml,含菌数为,50,100cfu,的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养,5,7,天，加入,3,5ml,含,0.05,（,v/v,）聚山梨酯,80,的,0.9%,无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含,0.05,（,v/v,）聚山梨酯,80,的,0.9%,无菌氯化钠溶液制成每,1ml,含孢子数,50,100cfu,的孢子悬液。,菌悬液在室温下放置应在,2,小时内使用，若保存在,2,8,可在,24,小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在,2,8,，在验证过的贮存期内使用。,适用性检查：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各,1ml,，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备,2,个平皿，混匀，凝固，置,30,35,培养,48,小时，计数；取黑曲霉,1ml,，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备,2,个平皿，混匀，凝固，置,23,28,培养,72,小时，计数；取白色念珠菌,1ml,，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备,2,个平皿，混匀，凝固，置,23,28,培养,72,小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。,结果判定：被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大于,70%,，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。,（,2,）计数方法的验证,验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。,（,3,）菌种及菌液制备同计数培养基的适用性检查,验证方法 验证试验至少应进行,3,次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。,试验组：平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液,1ml,和,50,100cfu,试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备,2,个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入,50,100cfu,试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。,菌液组：测定所加的试验菌数。,供试品对照组：取,1ml,供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。,稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每,1ml,供试液含,50,100cfu,，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。,结果判断,:,在,3,次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于,70%,。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于,70%,，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于,70%,，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。,若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅,对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。,计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。,（,4,）供试品检查,计数方法包括平皿法和薄膜过滤法（本试验采用的是平皿法）。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。,按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。用稀释液稀释成,110,、,110,2,、,110,3,等稀释级的供试液。,取供试液,1ml,，置直径,90mm,的无菌平皿中，注入,15,20ml,温度不超过,45,的溶化的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备,2,个平板（计数时取平均值）。阴性对照试验，取试验用的稀释液,1ml,，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备,2,个平板，均不得有菌生长。,一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。本试验中所用供试品含蜂蜜，应用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。,菌数报告规则,细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于,300cfu,、霉菌宜选取平均菌落数小于,100cfu,的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告,1mL,供试品中所含的菌数。,如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于,1,时，以,1,乘以最低稀释倍数的值报告菌数。,4,、控制菌检查,（,1,）控制菌检查用培养基的适用性检查,控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。检查项目包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。,菌种 对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。,菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养,18,24,小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养,24,48,小时。用,0.9%,无菌氯化钠溶液制成每,1ml,含菌数为,50,100cfu,的菌悬液。,菌悬液在室温下放置应在,2,小时内使用，若保存在,2,8,可在,24,小时内使用。,控制菌检查,培养基,特性,试验菌株,大肠,埃希菌,胆盐乳糖培养基,促生长能力,大肠埃希菌,抑制能力,金黄色葡萄球菌,MUG,培养基,促生长能力,+,指示能力,大肠埃希菌,曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂,促生长能力,+,指示能力,大肠埃希菌,大肠菌群,乳糖胆盐发酵培养基,促生长能力,大肠埃希菌,抑制能力,金黄色葡萄球菌,乳糖发酵培养基,促生长能力,+,指示能力,大肠埃希菌,曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂,促生长能力,+,指示能力,大肠埃希菌,沙门菌,营养肉汤,促生长能力,乙型副伤寒沙门菌,四硫磺酸钠亮绿培养基,促生长能力,乙型副伤寒沙门菌,抑制能力,金黄色葡萄球菌,胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂,促生长能力,+,指示能力,乙型副伤寒沙门菌,曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂,促生长能力,+,指示能力,乙型副伤寒沙门菌,适用性检查,:,控制菌检查用培养基的适用性检查所用的菌株及检测项目见表,1,THANK YOU,SUCCESS,2025/3/20 周四,25,可编辑,铜绿,假单胞菌,胆盐乳糖培养基,促生长能力,铜绿假单胞菌,抑制能力,金黄色葡萄球菌,溴化十六烷基三甲铵琼脂,促生长能力,铜绿假单胞菌,抑制能力,大肠埃希菌,绿脓菌素测定用培养基,促生长能力,+,指示能力,铜绿假单胞菌,金黄色,葡萄球菌,亚碲酸盐肉汤培养基,促生长能力,金黄色葡萄球菌,抑制能力,大肠埃希菌,卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇盐琼脂,促生长能力,+,指示能力,金黄色葡萄球菌,抑制能力,大肠埃希菌,梭菌,梭菌增菌培养基,促生长能力,生孢梭菌,哥伦比亚琼脂,促生长能力,生孢梭菌,白色,念珠菌,沙氏葡萄糖肉汤,促生长能力,白色念珠菌,沙氏葡萄糖琼脂,促生长能力,+,指示能力,白色念珠菌,念珠菌显色培养基,促生长能力,+,指示能力,白色念珠菌,抑制能力,大肠埃希菌,吐温,80,玉米琼脂培养物,促生长能力,+,指示能力,白色念珠菌,增菌培养基促生长能力检查：,分别接种不大于,100cfu,的试验菌（见表,1,）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。,固体培养基促生长能力检查：,取试验菌各,0.1ml,（含菌数,50,100cfu,）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。,培养基抑制能力检查：,接种不少于,100cfu,的试验菌（见表,1,）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。,固体培养基指示能力检查：,取试验菌各,0.1ml,（含菌数不大于,100cfu,）（见表,1,）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。,液体培养基指示能力检查：,分别接种不大于,100cfu,的试验菌（见表,1,）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。,（,2,）控制菌检查方法的验证,当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。,验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。,菌种及菌液制备：同控制菌检查用培养基的适用性检查,验证方法,取,1ml,供试液及,1ml,试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取,1ml,供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。,结果判断,若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。,（,3,）供试品检查,供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。,阳性对照试验：供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为,1ml,，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。,阴性对照试验：取稀释液,10ml,照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。,大肠埃希菌（,Escherichia coli,）,取供试液,10ml,（相当于供试品,1ml,），直接接种至,100ml,的胆盐乳糖培养基中，培养,18,24,小时，必要时可延长至,48,小时。,取上述培养物,0.2ml,，接种至含,5ml MUG,培养基的试管内，培养，于,5,小时、,24小时在,366nm,紫外线下观察，同时用未接种的,MUG,培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为,MUG,阳性；不呈现荧光，为,MUG,阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为,MUG,阴性和靛基质阴性。,如,MUG,阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如,MUG,阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如,MUG,阳性、靛基质阴性，或,MUG,阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养,18,24,小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表,2,所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表,2,所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。,表,2,大肠埃希菌菌落形态特征,培 养 基,菌 落 形 态,曙红亚甲蓝琼脂,呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽,麦康凯琼脂,鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润,大肠菌群（,Coliform,）,取含,10ml,的乳糖胆盐发酵培养基管,3,支，分别加入,110,的供试液,1ml,（含供试品0.1ml,）、,1100,的供试液,1ml,（含供试品,0.01ml,）、,11000,的供试液,1ml,（含供试品,0.001ml,），另取,1,支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液,1ml,作为阴性对照管。培养,18,24,小时。,乳糖胆盐发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养,18,24,小时。,若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表,3,所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表,3,所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。,表,3,大肠菌群菌落形态特征,培 养 基,菌 落 形 态,曙红亚甲蓝琼脂,呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润,麦康凯琼脂,鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润,确证试验 从上述分离平板上挑选,4,5,个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养,24,48,小时。若产酸产气，判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。,表,4,可能的大肠菌群数表,根据大肠菌群的检出管数，按表,4,报告,1ml,供试品中的大肠菌群数。,各供试品量的检出结果,可能的大肠菌群数,N,（个,/ml,）,01ml,0.01ml,0.001ml,+,+,+,-,+,+,-,-,+,-,-,-,10,3,10,2,N,10,3,10,N,10,10,注：,+,代表检出大肠菌群；,-,代表未检出大肠菌群。,沙门菌（,Salmonella,）,取供试品,10ml,，直接或处理后接种至,200ml,的营养肉汤培养基中，用匀浆仪混匀，培养,18,24,小时。,取上述培养物,1ml,，接种于,10ml,四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养,18,24,小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基的平板上，培养,18,24,小时（必要时延长至,40,48,小时）。,若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表,5,所列的特征，判供试品未检出沙门菌。若平板上生长的菌落与表,6,所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选,2,3,个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养,18,24,小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判断供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的鉴定试验，确认是否为沙门菌。,表,5,沙门菌菌落形态特征,培 养 基,菌 落 形 态,胆盐硫乳琼脂,无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色,沙门、志贺菌属琼脂,无色至淡红色、半透明或不透明，菌落中心有时带有黑褐色,曙红亚甲蓝琼脂,无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落,麦康凯琼脂,无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色,铜绿假单胞菌（,Peudomonas aeruginosa,）,取供试液,10ml,（相当于供试品,1ml,），直接接种至,100ml,的胆盐乳糖培养基中，培养,1824,小时。取上述培养物，划线接种于绣花十六烷基三甲胺琼脂培养基的平板上，培养,1824,小时。,铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或与上述菌落形态特征不符，判断供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选,23,个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养,1824,小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。,氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的,1%,二盐酸二甲基对苯二胺试液，在,30,秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。,若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。,绿脓菌素,(,Pyocyanin,),试验 取斜面培养物接种于,PDP,琼脂培养基斜面上，培养,24,小时，加氯甲烷,35ml,至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入,1mol/L,盐酸试液约,1ml,，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的,POP,琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。,若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。,表,6,金黄色葡萄菌菌落形态特征,金黄色葡萄球菌（,Staphylococcus aureus,）,取供试液,10ml,（相当于供试品,1ml,），直接接种至,100ml,的亚碲酸钠肉汤培养基中，培养,1824,小时必要时可延长至,48,小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养,2472,小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表,6,所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。,培 养 基,菌 落 形 态,甘露醇氯化钠琼脂,金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径,0.71mm,卵黄氯化钠琼脂,金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径,12mm,若平板上生长的菌落与表,7,所列的菌落特征相符或疑似，应挑选,23,个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养,1824,小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养,1824,小时，作血浆凝固酶试验。,血浆凝固酶试验：取灭菌小试管,3,支，各加入血浆和无菌水混合液（,1,：,1,）,0.5ml,，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物,0.5ml,、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养,0.5ml,、营养肉汤或,0.9%,无菌氯化钠溶液,0.5ml,，即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将,3,管同时培养，,3,小时后开始观察直至,24,小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阴性对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。,若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性判供试品未检出金黄色葡萄球菌、,梭菌（,Clostridium,）,取供试液,10ml,（相当于供试品,1ml,）,2,份，其中,1,份置,80,保温,10,分钟后迅速冷却。上述,2,份供试液直接或处理后分别接种至,100ml,的梭菌増菌培养基中，置厌氧条件下培养,48,小时。取上述每一培养物,0.2ml,，分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下培养,4872,小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选,23,个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。,过氧化氢酶试验：取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加,3%,过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。,若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽胞，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。,白色念珠菌（,Candida albicans,）,取供试液,10ml,（相当于供试品,1ml,）直接接种至,100ml,的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养,4872,小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养,2448,小时（必要时延长至,72,小时）。,白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有褶皱。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选,23,个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养,2448,小时（必要时延长至,72,小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。,若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于,1%,吐温,80-,玉米琼脂培养基上，培养,2448,小时。取培养物进行染色，镜检及牙管试验。,牙管试验,:,挑取,1%,吐温,80-,玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置,3537,、,13,小时，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。,若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。,三、结果判断,供试品间隙控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。,供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以,3,次结果的平均值报告菌数。,若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数、控制菌三项检验结果符合该品种项下的规定，判断符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。,限度标准,细菌数，每,1ml,不得过,100cfu,。霉菌和酵母菌数，每,1ml,不得过,100cfu,。大肠埃希菌，每,1ml,不得检出。每,10ml,还不得检出沙门菌。,THANK YOU,SUCCESS,2025/3/20 周四,48,可编辑,