雌二醇对大鼠心肌缺血_再灌注损伤的干预作用及其机制.pdf

雌二醇对大鼠心肌缺血 再灌注损伤的干预作用及其机制冯静茹，张海洋，史贺，王腾飞，王紫监，程光慧，毕胜利（河北北方学院附属第二医院妇科，河北北方学院附属第二医院心内科，河北北方学院附属第二医院检验科，张家口 ；石家庄市第四医院药剂科，河北 石家庄 ）【摘要】目的：研究雌二醇（）通过雌激素受体 （）介导细胞外调节蛋白激酶（）通路激活减轻心肌缺血 再灌注（）损伤的作用及机制。方法：只成年雌性 大鼠进行去卵巢手术并随机分为：对照组、腺相关病毒（）组进行假手术，组、组、组、组、组。采用冠状动脉左前降支结扎的方法制备心肌 损伤模型，组、组、组造模前给予 灌胃、连续 ，组、组、组造模前 给予相应 尾静脉注射。再灌注 后，检测血清乳酸脱氢酶（）、磷酸肌酸激酶（）、磷酸肌酸激酶同工酶（）含量，心肌梗死面积，心肌中 、表达水平及肿瘤坏死因子 （）、白介素 （）、丙二醛（）、总抗氧化力（）的含量。结果：组的血清 、含量、心肌梗死面积及心肌中 、的含量均高于对照组，心肌中 、的表达水平及 的含量均低于对照组（）；组的血清 、含量、心肌梗死面积及心肌中 、的含量均低于 组，心肌中 、的表达水平及 的含量均高于 组（）；尾静脉注射 敲低 的表达后，组的血清 、含量、心肌梗死面积及心肌中 、的含量均高于 组，心肌中 、的表达水平及 的含量均低于 组（）。结论：雌二醇对去卵巢大鼠心肌 损伤具有保护作用，该作用与促进 介导 通路激活、减轻炎症反应及氧化应激反应有关。【关键词】心肌缺血 再灌注；雌二醇；雌激素受体 ；细胞外调节蛋白激酶；炎症反应；氧化应激；大鼠【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）【】，（，；，；，；，）【】：（）（）（）（）：，（），（），（），（），（），（），（）（）：，（），（）（），（）：，【】；【基金项目】河北省卫健委 年医学科学研究课题计划（）【收稿日期】【修回日期】【通讯作者】：；：绝经后女性是发生心脑血管疾病的高危人群，造成心脑血管疾病发生风险增高的直接原因是绝经后雌激素缺乏、心血管系统失去了雌激素的保护作用 ，。急性冠脉综合征（，）是一组以冠状动脉粥样斑块形成及稳定性改变为特征的临床疾病谱，经皮冠状动脉介入术是治疗 的有效手段，能够再通闭塞或狭窄的冠脉、使缺血心肌获得血流再灌注。缺血 再灌注（，）是治疗过程中必经的病理生理过程，会造成心肌损伤加重、即 损伤。已有研究表明，雌激素缺乏会加重心肌 损伤，补充雌二醇（）可减轻 损伤 ，雌激素通过雌激素受体（，）发挥生物学作用。经典的 受体 、均属于核受体，与雌激素反应元件结合后调控靶基因的转录。目前关于雌激素心血管保护作用的研究主要集中在 ，敲除 使雌激素减轻心肌 损伤的作用减弱，但目前对 在雌激素减轻心肌 损伤中的作用尚不十分清楚。一项骨关节炎的研究证实 通过 介导的细胞外调节蛋白激酶（，）通路激活减轻软骨细胞损伤 。本研究将已去卵巢大鼠为研究对象，观察 通过 介导 通路激活减轻心肌 损伤的作用及机制，旨在进一步地探讨绝经后的女性心血管疾病发生、激素缺乏加重心肌 损伤的分子机制。材料与方法 实验动物成年雌性 大鼠、体质量 、周龄，购自上海西普尔 必凯实验动物公司，生产许可 （沪）。试剂与仪器 为 公司（美国）、，氯化三苯基四氮唑（），阴性对照 腺相关病毒（）、腺相关病 毒（）为吉凯基因公司（中国上海），滴度为 ，乳酸脱氢酶（）、磷酸肌酸激酶（）、磷酸肌酸激酶同工酶（）检测试剂盒及肿瘤坏死因子 （）、白介素 （）的酶联免疫吸附法试剂盒为酶联实业公司（中国上海），特异性一抗为 公司（美国），、特异性一抗为 公司（美国），丙二醛（）、总抗氧化力（）检测试剂盒为建成研究所（中国南京）。分组及给药雌性 大鼠在温度 、相对湿度 、自然采光、通风的环境中预适应饲养 后进行去卵巢，而后进行分组。为研究 对心肌 损伤的保护作用，实验动物分为对照组、组、组，每组各 只，对照组进行假手术操作，组进行心肌 损伤造模，组在 干预后进行心肌 损伤造模；为研究 在 减轻心肌 损伤中的作用，实验动物分为 组、组、组、组，每组各 只，组给予 尾静脉注射后进行假手术操作，组给予 尾静脉注射后进行心肌 损伤造模，组给予 干预、尾静脉注射后进行心肌 损伤造模，组给予 干预、尾静脉注射后进行心肌 损伤造模。心肌 损伤造模方法如下：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后开胸、显露心脏、分离冠状动脉左前降支，在左心耳下方 处穿线并结扎，使心肌缺血 ，小动物心电图监测证实 段抬高视为造模成功，松开线结、再灌注 ；对照组和 组进行假手术操作，包括麻醉、开胸、显中国应用生理学杂志，（）露心脏、分离冠状动脉左前降支及穿线，但不进行结扎。在心肌 造模前给予 干预，配置浓度 的 溶液、按照 的剂量进行灌胃，每天 次、连续 ，末次灌胃后 进行心肌 造模。在心肌 造模前 、即末次灌胃后即刻，组、组、组给予 尾静脉注射，单次注射、体积 只；组给予 尾静脉注射，单次每只注射 。血清心肌酶含量的检测每组随机挑选 只大鼠，再灌注 后经心尖取血约 ，静置 凝血后 离心 ，分离血清并采用试剂盒检测 、的含量。心肌梗死面积的检测完成经心尖取血后过量麻醉处死大鼠，解剖心脏，用生理盐水清洗后沿纵轴切成 片组织片，放入 溶液并在室温孵育 ，完成染色后用生理盐水清洗，而后拍照记录；图像输入 软件，计算每片心肌组织中梗死面积、左心室面积，计算梗死面积 左心室面积的比值。心肌中蛋白表达水平的检测每组剩余的 只大鼠，再灌注 后过量麻醉处死，收集对照组、组的左心室心肌组织及其余各组大鼠的梗死部位心肌组织。将约 组织加入裂解液中，匀浆提取组织蛋白并检测浓度，将含有 蛋白的样本加入聚丙烯酰胺凝胶中进行 实验。电泳分离不同分子量的蛋白后电转移至硝酸纤维素膜，用 脱脂牛奶室温封闭硝酸纤维素膜 ，用 一抗（稀释）、一抗（稀释）、一抗（稀释）、一抗（稀释）孵育硝酸纤维素膜过夜。次日，用辣根过氧化物酶二抗（稀释）室温孵育硝酸纤维素膜 ，最后在凝胶成像系统（上海天能公司，中国）内显影得到蛋白条带，计算 灰度值 灰度值、灰度值 灰度值。心肌中炎症反应及氧化应激指标的检测取对照组、组左心室心肌组织及其余各组大鼠梗死部位心肌组织的蛋白样本，采用试剂盒检测 、的浓度及蛋白浓度，计算每毫克蛋白中 、的含量。统计学处理实验数据均为计量资料，以均数 标准差（珋 ）表示，采用 软件录入数据，多组间比较采用单因素方差分析、两两比较采用 检验。结果 对心肌 损伤大鼠血清心肌酶的影响 组大鼠的血清 、含量均高于对照组，组大鼠的血清 、含量均低于 组（，表 ）。，（，珋 ，），；，对心肌 损伤大鼠心肌梗死面积的影响对照组大鼠未出现心肌梗死，组大鼠的心肌梗死面积为（），组大鼠的心肌梗死面积为（）。组大鼠的心肌梗死面积高于对照组，组大鼠的心肌梗死面积显著低于 组（）。对心肌 损伤大鼠心肌中 、表达的影响 组大鼠心肌中 、的表达水平低于对照组，组大鼠心肌中 、的表达水平高于 组（，图 ）。，（，珋 ，），；，（）对心肌 损伤大鼠心肌炎症反应及氧化应激反应的影响 组大鼠心肌中 、的含量高于对照组，的含量低于对照组（）。，（珋 ，）（）（）（）（），；，对 增加心肌 损伤大鼠心肌中 、表达的影响 组大鼠心肌中 、的 表 达 水 平 低 于 组（），组大鼠心肌中 、的表达水平高于 组（），组大鼠心肌中 、的表达水平低于 组（）。（珋 ，），；，；，对 降低心肌 损伤大鼠血清心肌酶的影响 组大鼠的血清 、含量高于 组（），组大鼠的血清 、含量低于 组（），组大鼠的血清 、含量高于 组（）。对 缩小心肌 损伤大鼠心肌梗死面积的影响 组大鼠未出现心肌梗死，组、组、组大鼠的心肌梗死面积分别为（）、（）、（）。组大鼠的心肌梗死面积高于 组（），（，珋 ，），；，；，组大鼠的心肌梗死面积低于 组（），组大鼠的心肌梗死面积高于 组（）。对 减轻心肌 损伤大鼠心肌炎症反应及氧化应激反应的影响 组大鼠心肌组织中 、的含量高于 组，的 含 量 低 于 组；组大鼠心肌组织中 、的含量低于 组，的含量高于 组（）；组大鼠心肌组织中 、的含量高于 组，的含量低于 组（）。中国应用生理学杂志，（），（珋 ，）（）（）（）（）；讨论心肌 损伤是 患者接受再灌注治疗后必经的病理生理过程，不仅直接加重心肌损害，还增加近期及远期不良心血管事件的发生风险，因此需要积极防治。雌激素具有心血管保护作用，绝经后女性因为雌激素缺乏、心血管事件的发生风险明显增加。不仅如此，近些年的临床研究还发现绝经后女性发生 后的病情较重 ，另有基础研究证实在模拟绝经后状态的去卵巢大鼠中进行心肌 造模、心肌的损害程度较未去卵巢雌性大鼠的心肌 损害程度更重 ，。以上结果提示绝经后雌激素缺乏不仅增加心血管事件的发生风险，还加重心血管事件发生后的心肌损害程度、加重心肌 损伤。本研究将对相关的分子机制进行探索。雌激素发挥心血管保护的生物学作用与核受体 、有关，既往心血管系统中雌激素保护作用的相关研究主要集中在 ，敲除或敲低 能够削弱雌激素减轻心肌 损伤的作用，绝经后雌激素缺乏会使 途径的激活受阻、进而加重心肌 损伤 ，。但关于 在雌激素心血管保护作用中的生物学功能尚缺乏足够的基础研究证据。的一项动物实验证实在 的心肌组织中 、的表达水平均明显降低 ；本研究在去卵巢大鼠中也观察到 造模后心肌组织中 的表达水平明显降低，与 的实验结果 吻合。以上结果提示两种 可能均参与心肌 损伤的病理生理过程，绝经后雌激素缺乏可能同时通过 和 途径加重心肌 损伤。多项雌激素相关的基础研究已经在心肌细胞 、牙周膜细胞 、软骨细胞 等不同组织来源的细胞中证实 处理能够增加 及 的表达且 表达上调的幅度较 更大，提示 可能在雌激素介导的保护作用中起更为关键的作用。本研究在去卵巢大鼠进行心肌 损伤造模前给予 灌胃、连续 。经 灌胃后，心肌 损伤造模后血清心肌酶含量降低、心肌梗死面积缩小、心肌中 的表达水平增加，表明 减轻去卵巢大鼠的心肌 损伤、促进 途径激活，进而也提示激活 途径可能是 减轻心肌 损伤的相关机制。是一类核受体，参与多种靶基因表达的调控。国内一项研究在软骨细胞中证实 的保护作用与 介导的 通路激活有关 。以磷酸化的形式发生激活，的生物学作用包括抗炎、抗氧化等。已有研究报道心肌 损伤过程中 的磷酸化水平降低；促进 的磷酸化显著减轻心肌 损伤，也显著抑制炎症反应及氧化应激反应 。本研究在 损伤的心肌中检测到 的表达水平及 的含量降低，、的含量增加，与既往研究关于心肌 损伤过程中 磷酸化水平降低、炎症反应及氧化应激反应激活的报道一致。进一步在 干预后进行检测，损伤的心肌中 的表达水平增加且炎症及氧化应激反应均减轻，表明 减轻心肌 损伤与激活 并发挥抗炎、抗氧化作用有关，这也与 促进 途径激活的作用吻合。另外，本研究通过 注射的方式直接验证 在 减轻心肌 损伤中的作用，在 灌胃的同时于心肌 造模前 通过尾静脉注射 的方式敲低 的表达，与 灌胃后注射 的大鼠比较，注射 敲低 的表达后 使心肌 大鼠心肌酶含量降低、心肌梗死面积缩小、磷酸化水平增加、炎症及氧化应激反应减轻的作用明显减弱，表明 减轻心肌 损伤的作用至少部分依赖 介导的 通路激活。综上所述，能够减轻去卵巢大鼠的心肌 损伤，其分子机制可能是促进 介导的 通路激活，进而减轻炎症反应及氧化应激反应。这有助于进一步地了解绝经后女性心血管疾病的发病机制、雌激素缺乏加重心肌 损伤的分子机制，以对其治疗提供理论依据。，（）【参考文献】，（）：，：，（）：，（）：钱鲁，李卓远，张素勤雌二醇对小鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制 温州医科大学学报，（）：张梦颖，杨玉有，刘敏，等雌二醇通过 调控 磷酸化影响细胞增殖和凋亡 南方医科大学学报，（）：骆燕萍，俞艳烨，邹茜绝经前后冠心病患者临床特点雌激素及冠状动脉病变特征分析 中国妇幼保健，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：中国应用生理学杂志，（）