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桔梗总皂苷含量测定方法研究
【摘要】 目的建立一种香草醛-硫酸比色法测定桔梗中总皂苷含量的方法，为桔梗的质量控制提供科学依据。方法索氏提取器提取，大孔吸附树脂纯化，香草醛-硫酸比色法测定桔梗总皂苷含量。结果比色法测定的线性方程为A= 4C+ 4，相关系数为r= 7，平均加样回收率为%，RSD=%(n=6)。对不同来源桔梗中总皂苷含量进行测定，其含量范围为%～%。结论该法测定准确，重复性好，可用于桔梗药材中桔梗总皂苷的含量测定，便于对桔梗药材进行质量评价。
【关键词】 桔梗；总皂苷；桔梗皂苷D；比色法
　　Abstract：ObjectiveTo develop a vanillin -H2SO4 colorimetry method for the determination of total saponins in Radix Platycodonis samples, in order to provide a scientific basis for the quality control of Radix Platycodonis. MethodsWith Platycodin D as standard, the total saponins in Radix platycodonis was extracted with soxhlet extractor and purified with macroporous resin column chromatography, its content was determined by vanillin -H2SO4 colorimetry method. ResultsThe calibration curve of total saponins in Radix Platycodonis samples for this method was A= 4C+ 4, r= 7. The average recovery and RSD were % and %，respectively. The content range of total saponins in Radix platycodonis from different origins was from % to %. ConclusionThis determination method is practical, reproducible and can be used for evaluating the quality of Radix Platycodonis samples.
　　Key words：Radix Platycodonis; Total saponins; Platycodin D; Colorimetry

　　桔梗(Radix Platycodonis)为桔梗科(Campanulaceae)植物桔梗Platycodon grandiflorum的干燥根［1］，是一种药食同源的植物，用途广泛。桔梗性味苦、辛、平，归肺经，有宣肺、利咽、祛痰、排脓之功效，用于咳嗽痰多，胸闷不畅，咽痛，音哑，肺痈吐脓，疮疡脓成不溃，被广泛应用于祛痰止咳药［2］。桔梗中的皂苷类成分，是桔梗药用品质的主要评价指标，桔梗中含有大量的三萜皂苷，已经分离鉴别出四十多种单体皂苷，如桔梗皂苷D、桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D2、D3、桔梗皂苷E等［3～5］。现代药理学研究表明，桔梗皂苷为桔梗主要的药理活性成分［6］。《中国药典》(2005年版)采用重量法测定桔梗总皂苷含量，该方法操作繁琐，特别是其中糖类成分等杂质会对测定结果产生严重干扰，造成检测结果大大高于实际总皂苷的含量［7,8］。本实验以桔梗皂苷D为标准品，采用香草醛-硫酸显色，比色法对桔梗总皂苷的含量进行了测定。
　　1 仪器与材料1 仪器与试剂
　　UV2550型紫外—可见分光光度计(日本岛津)；TB-214型电子分析天平；数显恒温水浴锅HH-6；旋转蒸发仪R-205；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240；SK8200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵；大孔树脂层析色谱柱(内径3 cm，长30 cm)。标准品桔梗皂苷D (HPLC制备纯化，纯度用归一化法计算在98%以上)；AB—8型大孔吸附树脂(南开大学化工厂)；其他试剂均为分析纯。2 材料
　　桔梗样品共14个：GP1BC1-12和GP1BC2-6为3代不育株系，GSNH3-M3为2代粉花自交株系，种质来源于河北；GP2BC4-10和GP2BC4-5为3代不育株系，GS902-7-2为3代自交保持株系，种质来源于安徽；GS218-1，GS218-2和GS228-1为2代自交系，种质来源于山东；GS111-2为2代自交株系，GS262-W4-W2为3代自交保持株系，种质来源于赤峰；GS173-5为2代自交株系，来源于延庆野生种质；CK2为山东生产用种质，CK1为赤峰生产用种质［9］。以上各样品于200711初地上部分枯萎后，将其根部挖出，每个样品系内随机取3株，洗净，趁鲜刮去外皮，烘箱中60 ℃烘干，粉碎，粉末混合均匀后，装于自封袋中，置于干燥器中保存，备用。样品均采自药用植物研究所试验基地，由魏建和研究员鉴定。
　　2 方法与结果
　　标准品溶液的制备精密称取经60℃减压干燥至恒重的桔梗皂苷D　mg，加70%甲醇适量溶解，置1 ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
　　供试品溶液的制备取桔梗药材已干燥粉末约 g，准确称定，置索氏提取器中，加入10倍量的70%甲醇后，准确称重。浸泡30 min，加热回流提取3次，2 h/次，再次称重，补加70%甲醇至回流前重量。过滤，合并滤液于蒸发皿中，水浴蒸发至干，用10 ml水溶解残留物，将所得溶液缓缓通过已处理好的AB—8型大孔吸附树脂柱(重量比1∶20)，反复上样5次后，以水150 ml洗脱，弃去水液，之后再以300 ml 60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，蒸干。残留物用70%甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，定容，摇匀，即得［10］。
　　测定波长的选择精密移取80 μl的标准品及50 μl的供试品溶液，置10 ml具塞磨口试管中，于70℃水浴蒸发至干，精密加入10%香草醛试液 ml，60%硫酸5 ml，摇匀，于60℃水浴加热15 min，冰水浴中冷却3 min，随行试剂做空白，在紫外分光光度计于400～700 nm波长范围全程扫描［11］，标准品及供试品的最大吸收波长均在472 nm，且空白对照无干扰，故选择472 nm 为测定波长。
　　标准曲线的绘制精密吸取桔梗皂苷D标准品溶液0，40，80，160，200 μl,置10 ml具塞磨口试管中，于70℃水浴蒸发至干，精密加入10%香草醛试液 ml，60%硫酸5 ml，摇匀，于60℃水浴加热15 min，冰水浴中冷却3 min，以同法平行处理的空白溶剂为空白，在472 nm处测定吸光度。以标准品浓度C(μl/ml)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为:A= 4C+ 4，r= 7，结果看出C在此浓度系列范围内与A呈现良好的线性关系。
　　精密度实验精密吸取标准品溶液80 μl，按照“”项下方法显色测定吸光度，连续测定5次，结果RSD为%，说明仪器的测试性能良好。
　　稳定性实验精密吸取供试品溶液50 μl，按照“”项下方法操作，按不同时间测定其吸光度变化，在放置5，10，20，30，40，50，60 min后，吸光度分别为，，，，，，。结果表明该法在60 min内，吸光度值稳定。
　　重复性实验称取桔梗药材已干燥粉末6份，每份 g，准确称定，按照“”项下操作，制备6份供试品溶液，各准确移取50 μl，按照“”项下方法操作，测定吸光度A，计算总皂苷含量。结果平均含量为%,RSD为%。
　　加样回收率实验准确称取已知含量的桔梗药材已干燥粉末6份，每份 g，加入桔梗皂苷D适量，按照“”项下方法制备样品溶液，各取50 μl样品液，按照“”项下方法显色后测定吸光度，计算回收率。结果见表1。平均加样回收率为%,RSD为%(n=6)。表1 加样回收率实验结果
　　不同桔梗样品中总皂苷含量测定精确称取所采集的14种不同桔梗选育品系［12］，各3份，按照“”项下方法制备供试品溶液，各精密移取50 μl，按照“”项下方法显色后测定吸光度，从回归方程中计算供试品桔梗总皂苷的含量，其测定结果见表2。表2 桔梗总皂苷含量测定结果
　　3 讨论
《中国药典》(2005年版)采用重量法测定桔梗总皂苷含量，规定其含量不得少于6%，但是重量法操作繁琐，重复性不高，特别是其中糖类成分等杂质会对测定结果产生严重干扰，造成检测结果大大高于实际总皂苷的含量，结果误差较大。本方法采用大孔树脂纯化桔梗总皂苷，然后用比色法测定，虽然不同来源桔梗中总皂苷的含量范围为%～%，低于药典规定，但是本实验所采集样品均为一年生植株，且测定的是较纯的桔梗总皂苷，大大地减少了杂质的干扰。该方法简便，准确，且精密度高，重复性、稳定性均较好，平均回收率为%，可用于对桔梗药材进行质量评价。
GP代表桔梗不育系测交材料，GS代表桔梗自交系材料，CK为对照样品;n=3

　　通过大孔树脂纯化得到的提取液依“”项下方法显色，进行全波长扫描，得到的全波长扫描图，其最大吸收波长与标准品相差很小。同时弱极性的AB-8型大孔树脂的吸附率和解吸附率均比较理想，故AB-8型大孔吸附树脂在样品的纯化中不失为较好的选择。可见该方法可以有效的去除干扰，使测定结果更加准确。

　　结合文献，为简便桔梗总皂苷的提取，多采用超声提取法代替回流提取法，笔者总结了超声提取法的提取条件为：用10倍量甲醇在40℃，100%功率下超声提取3次，30 min/次。但与加热回流提取法所得提取液同时用紫外分光光度计测定吸光值，超声法所得提取液远远低于回流法。所以笔者放弃超声提取法，选用了更为准确的加热回流提取法。
【参考文献】
　　［1］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社，2005:196.
　　［2］魏尚洲. 桔梗资源的综合开发利用［J］. 陕西科技大学学报, 2005, 23(5): 141.
　　［3］Lee J Y，Hwang W I，Lim S　and anticancer activities of organic extracts from Platycodon grandiflorum A，De Candolle roots［J］．J Ethnopharmacol，2004，93(2-3)：409.
　　［4］吴碧元，孙军，蒋红芳. 桔梗提取工艺的研究［J］.中药材，2002，25：430.
　　［5］何美莲，程小卫，陈家宽，等．桔梗皂苷类成分及其质量分析［J］．中药新药与临床药理，2005，16(6)：457.
　　［6］Kim YS，Kim JS，Choi SU．Isolation of a new saponin and cytotoxic effect of saponins from the root of Platycodon grandiflorum on human tumor cell lines［J］．Planta Med，2005，71(6)：566.
　　［7］石俊英，董其亭，巩丽丽，等.不同产地桔梗中总皂苷成分与质量的相关性研究［J］.山东中医药大学学报，2006，30：247.
　　［8］李喜凤，薛秋萍，董诚明.桔梗中总皂苷的含量测定［J］.中医药学刊，2006，12：2232.
　　［9］魏建和，黄璐琦，陈士林，等．桔梗柱头、花粉活力及自交亲和性研究［J］．中国中药杂志，2006，31(5)：367.
　　［10］杨献文，刘墨祥，刘云刚，等．大孔吸附树脂柱色谱法分离桔梗总皂苷［J］．吉林农业大学学报，2001，23(2)：50.
　　［11］闫子鹏，薛锦峰. 紫外分光光度计测定大豆中的总皂苷的方法［J］.大豆通报，2005,2：28.
　　［12］魏建和，杨世林，李先恩，等．桔梗不同种质的比较研究-桔梗的杂交及花色、种色的新类型与分离［J］．中草药，2002，33(5)：455．