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多肽合成思考/练习题

1. 目前多肽的常见定义？多肽的结构单元？
α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，其分子量不超过 10,000 ，并且不存在三级以上结构。 结构单元是氨基酸
2. 多肽的类别及其分类原则，
3. 多肽固相合成法、液相合成法的对应英文？
4. Fmoc Chemistry 固相合成单循环包括几个步骤？对应名称？

大小 9肽以下 寡肽
15肽以下 小肽
15-50肽 中肽
多于50肽 大肽
结构 同聚肽: 线性肽, 环肽
杂聚肽: 色素肽,糖肽,脂肽,缩酯肽
来源 抗菌肽,激素肽,毒肽
液相合成法 Liquid phase peptide synthesis,LPPS
固相合成法 Solid phase peptide synthesis,SPPS
Fmoc Chemistry 固相合成单循环 ：缩合，洗涤，去保护， 中和及洗涤， 下一轮 缩合

5. 多肽合成中常见副产物有哪些？
6. 多肽偶联反应的最高追求？
7. 多肽裂解中常常加入俘获剂（Scavengers）。Scavengers的主要作用是啥？常见俘获剂有哪些？各自特点？
副产物：形成天冬酰亚胺，或发生差向异构化作用
8. 多肽合成中如何检查偶联反应的完成程度、树脂替代度和Fmoc脱除程度？
9. 解决困难肽序合成的常见方法？各自特点？
10. 请比较经Boc-、Fmoc-、Z-三种保护基保护的氨基酸的特点。

11. 多肽固相合成中产生二酮哌嗪(diketopiperazine，DKP)是一常见副反应。请给出产生二酮哌嗪的主要原因以及减少DKP形成的常见方法。
减少DKP形成的常见方法:使用与叔丁基等效的大基团来以位阻阻止DKP的形成。
12. 请给出多肽消旋的主要原因以及目前公认的2种机理P157。
多肽合成过程中，部分氨基酸在活化的过程中会导致不同程度的消旋，特别容易消旋的氨基酸有：Cys，His，Phe，当然这些消旋化还和溶剂，温度以及合成中的有机碱等因素有关。对于这些氨基酸，可以通过采用高效缩合试剂，减少反应时间，可以减少消旋的比例
13. 给出常见的巯基保护剂P131，请给出二硫键的常见形成方法。
二硫键的常见形成方法：（ oxidative folding
将自由巯基置于包含氧化还原体系e.g.谷胱甘肽的缓冲溶液中进行桥连） 1. 空气氧化形成二硫键 肽溶解在10–3 to 10–4 M 稀醋酸溶液中或0.05 M 得醋酸铵中。调整pH在7.5 and 8 之间，室温下暴露空气搅拌。添加剂 1–10 % DMSO or 3% H2O2 可以加入来加速反应。
2.碘氧化法3. 铁氰化钾氧化法
14. 简述Z-保护基的引入方法、Z-保护氨基酸的特点？
15. Z-保护基的脱除方法？各自特点？
16. 简述多肽固相合成法的优点、缺点。
优点：(1) 过量原料、辅助试剂溶于反应溶剂,接肽反应在固相载体上完成;反应完成后,过量原料、辅助试剂可被简单恰当的洗涤过程除去,操作简便;
(2)可以通过试剂过量来提高反应速度和反应程度;
(3)液相合成中,分子内环化反应、多位点的选择性反应通常采用高度稀释来避免副反应的发生；固相合成勿需高度稀释, 因为固相载体的反应位点基本保持在一定的距离(假稀释)。
(4) 因为简单、重复和快速的特点,固相合成容易实现自动化；
(5)劳动强度较小,对生产人员的专业技能要求较低。
缺点：1)反应速度相对较慢（异相反应）；
(2)载体和连接分子溶胀性的限制,固相合成不适于大规模制备；
(3)树脂价昂,试剂过量很多,原料成本高；
(4)合成过程中难以避免的缺损肽的存在,各种副反应所生成的消旋肽和异构肽等的出现,以及脱保护过程中因保护基的残留、肽键的断裂、烷基化等产生的杂质,分离纯化极为困难;
(5)合成的肽越长,经过的循环次数越多,目标分子的收率越低,纯化越困难;等。
17. 简述多肽液相合成法的优点、缺点。
优点：方法多样性(可以使用所有成熟的有机合成方法)；
均相反应,热分散性好,反应速度快;
大量反应可以通过控制反应釜的大小和反应物的数量而实现;
可以在每个步骤提纯、分析和鉴定产物,保证每一步原料的纯度;
不需要昂贵的树脂,投料比低(原料成本低);
缺点：(1).反应结束后,剩余原料、产物和副产物都在反应混合物中, 需要分离纯化。
(2).分离纯化常用方法
全保护多肽：萃取洗涤；硅胶柱层析；重结晶；
去保护多肽：重结晶；液相色谱柱。
因此,后处理相当费时、劳动强度大而且麻烦
(3).液相合成难以实现自动化；
(4).对合成人员的专业技能要求很高；
(5).大肽合成溶剂的选择很困难。
18. 简述多肽合成方法的选择原则。
19. 给出Fmoc chemistry 固相合成的一般流程。
• 首先将保护的Fmoc氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸―支臂―树脂。
• 将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去。此外，也可以用α-N端及侧链保护的肽片断代替单个的氨基酸进行耦联反应，缩合反应完成后，用溶液洗涤；
• 重复进行脱保护、耦联，直到得到目的肽。
• 最后将肽―支臂―树脂裂解。
20. 多肽固相合成对树脂的要求有哪些？选择树脂的原则?
树脂的要求：（1）化学稳定性
（2）对各种溶剂的不溶性
（3）良好的溶胀性（Swelling）
（4）具有一定的机械强度
21. 何为载体树脂P163？载体的功能? 给出你知道的常见载体。
常见载体：
名称
材 料
性 能 及 用 途
白球树脂
聚苯乙烯（PS）
强度好价廉,适于各种有机溶剂
sheppard
聚丙烯酰胺
价廉稳定性差适于水及有机溶剂
Tenta-gel
PS-PEG
适于各种极性非极性溶剂价贵
Poly-pins
聚乙烯
基本无溶涨性适合平行多重合成

22. 载体树脂一般有哪几个指标? 如何调节？
23. 树脂溶胀的常用溶剂有哪些？各自特点？
24. 树脂实用前一般需要溶胀。溶胀的作用、方法和注意事项？
方法：
• Complete swelling of the dry resin may take up to 1 hour.
• A. Unmodified crosslinked polystyrene聚苯乙烯 and chloromethylated polystyrene氯甲基化聚苯乙烯
• swelling capacity
• Strong（DCM,Dioxane,Toluene） weak（alcohols,water）
• 中间 DMF
• B. Derivatized polystyrene
depends on the load and the polarity of the functional groups.
溶胀的作用：树脂溶胀后体积变大获得较好的结合位点，从而使反应顺利进行，而且在形成长链时溶胀还可以起到稀释作用位点和反映试剂的作用
注意事项 ：
25. 给出影响多肽偶联的外因。如何利用或避免？
26. 树脂突然收缩的原因是什么？如何避免？
27. 多肽合成中的洗涤操作非常重要。请说明洗涤的作用、方法。为何常常选用不同溶剂交叉洗涤？
28. 固相多肽合成中，树脂必不可少。常见树脂种类有哪些？不同种类树脂选用的原则？
1.Resins for the Synthesis of Peptide Acids2. Resins for the Synthesis of Peptide Amides3. Resins for the Synthesis of Fully Protected Peptide Fragments 4. Resins for the Synthesis of Peptide Alcohols
不同种类树脂选用的原则Peptide Amides ：Resin contains aminomethyl readily cleavagable by TFA；
Fully Protected Peptide Fragments：Those resins containing linkers quite stable for bases but faiely labile to mild acids
29. 肽酸、肽酰胺、肽醇合成所用的树脂各有哪些?各自特点?请列表说明。
肽酸 Wang Resin and Preloaded Wang Resins

30. 片段合成常用树脂有哪些?各自特点? 请列表说明。
31. 对我们课堂讲授过的Linker 进行合理的总结。
Linker是一个双功能的分子将逐渐增长的肽链链接到不溶性载体上。C端Fmoc amino acid 可以与linker偶合产生出一个被称作handle
的东西，它在投聚合物的时候可以先惊醒纯化。
(4-(3-hydroxy-3-methyl-butyl)-phenoxy)-acetic acid
a “tert.butyl-equivalent” anchor especially suitable for the synthesis of peptides with a C-terminal Pro since DKP formation is suppressed by its bulkiness

Fmoc-2,4-dimethoxy-4’- (carboxymethyloxy)- benzhydrylamine
For the synthesis of peptide amides

Fmoc-4-methoxy-4’-(-carboxy- propyloxy)-benzhydrylamine
For the synthesis of peptide amides

4-Formyl-3-methoxy-phenoxyacetic acid
• May be reduced to the alcohol before or after coupling; it can also be used as a formyl anchor e.g. for reductive amination.

2-Hydroxy-5-dibenzosuberone
• Reacts with resins carrying chloromethyl groups.

4-Hydroxymethylbenzoic acid
• An anchor especially suited for cleavage
with nucleophiles, thus Boc should be preferred for N-protection.

4-Hydroxymethyl-3-methoxy-phenoxyacetic acid
• Somewhat less acid-labile than SASRIN.

• 4-Hydroxymethyl-phenoxyacetic acidA “Wang equivalent”.

4-(Fmoc-hydrazino)-benzoic acid
Acid-base stable linker which can yield various esters/amides upon the cleavage from the resin requiring a Cu(II) catalyst and a nucleophile.

4(4-(1-hydroxyethyl)-2-methoxy5-nitro-phenoxy)-butyric acid
• A photolabile linker releasing the peptides as carboxylic acids.

32. 多肽合成中Fmoc的脱除非常重要。简要说明Fmoc的脱除试剂、脱除方法、检验方法。
Fmoc group 通过碱诱导的消除反应除去。当DBU等不与dibenzofulvene反应的碱时需要额外加入二级碱，以便迅速从肽树脂中除去dibenzofulvene，或者也可加入二级胺如六氢吡啶，以防止发生不可逆转的dibenzofulvene与才释放的氨基的附着。可用UV来检测。

脱除试剂: 仲胺如piperidine,及DBU等
脱除方法: a short treatment (3 - 5 minutes) with piperidine/DMF (1:4).通常该过程都要重复进行并适当延长时间(7-10 minutes). 由此也就制约了缓慢裂解和对碱敏感的过程。
检验方法：UV来检测
33. Fmoc的脱除的实际用途有哪些？给出其实验操作步骤。
实际用途有 测定替代度，测定肽的偶联效应等
实验操作步骤
34. 多肽合成完成后，需要将肽树脂的树脂切割下来。简述典型树脂的切割方法和选择原则。
35. 简述氨基酸树脂合成的操作方法、替代度测定方法及其操作

The Fmoc Group STABILITY Fmoc is acid-stable, withstands cleavage of Boc/tBu (TFA) and Z/Bzl (HF). Fmoc is stable under the cleavage conditions of Aloc/All烯丙氧羰基/烯丙基 (Pd°).
LIMITED STABILITY
Towards tertiary amines such as DIPEA二异丙基乙基胺, pyridine;
The relative stability depends on base concentration, solvent and temperature.
Stability towards hydrogenolysis氢解 is controversial and should be evaluated for each individual case.
对伯胺不稳定，包括偶合反应所用的氨基酸上的氨基，因而在很缓慢的偶合过程中会发生Fmoc的过早裂解。在偶合位点的N-甲硅烷基化可组织这个副反应提高偶合效率。
Harsher粗糙 cleavage – 1 -- 5% DBU/DMF, more reactive than piperidine, for glycopeptides糖肽累;– 20% piperidine and 1–5% DBU in DMF, for difficult deblockings;
– Morpholine吗啉/DMF (1:1), milder than piperidine for highly sensitive glycopeptide糖肽
– piperidine/DMF (1:4) at 45°C, for “difficult sequences” ;
– 0.1 M HOBt in piperidine/DMF (1:4), suppression of DKP and aspartimide formation 抑制DKP和天冬酰亚胺的形成;– Bu4N+F– in DMF and other tetraalkyl -ammonium fluorides四烷基氟化铵 ; (not recommended),– 2% HOBt, 2% hexamethyleneimine（六亚甲基亚胺,环己亚胺）, 25% N-methylpyrrolidineN-甲基四氢吡咯 in DMSO/NMP 1:1, mild cleavage keeping thioesters intact硫酯的完整性 .
无论哪一裂解试剂优先，在Fmoc出去之前都该仔细的清洗，最后一次清洗应该用中性。当合成巨大的肽时，裂解Fmoc的持续时间应该之间增加。为了安全除去去封闭试剂，是指应该清洗地频率更高
)Treat with´Prewash with DMF (2 piperidine/DMF (1:4), 5 and 10 minutes, 10 mL of reagent/g peptide-resin.Wash alternately with DMF and IPA until neutral pH.
对酸超级敏感的树脂Fmoc is readily detected at 254 nm 。For further analysis e.g. by HPLC, the peptide may be isolated and deprotected with TFA as described below.
For Other resins and large peptides
Treat with 95% aq TFA containing 5% EDT (or TIS) for at least 1 hr.Filter off the resin and precipitate the peptide with MTBE甲基叔丁醚.Minute amounts of Fmoc peptide can be detected by HPLC , TLC or MS.
Side-Chain Protecting Groups 正交保护策略 Orthogonal protection schemes allow for milder overall reaction conditions as well as the synthesis of partially protected peptides。。Fmoc/tBu probably represents the most popular “orthogonal”正交的 combination of protecting groups. combination of Z/Bzl has been termed “quasiorthogonal”. 近似正交
侧链环化通常通过酰胺键e.g.增加肽的刚性来来稳定预期的构型。已经设想出了依赖正交侧链保护基的恰当合成策略，这样环化即可在树脂上实现亦可在受保护的线性前体从树脂上裂解下来之后进行。
Aloc Allyloxycarbonyl Mtt 4-Methyltrityl
OPp 2-Phenylisopropyl ester Adpoc 2-(1’-Adamantyl)-2-propyloxycarbonyl
Dde 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxo-cyclohexylidene)-3-methylbutyl
ODmab 4-{-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxo-cyclohexylidene)-3-methylbutyl]-amino}-benzyl ester

All/Aloc and Dmab/Dde 被 广泛的用于与树脂简练的肽的侧链环化，通过酰胺键
if treatment with 1% TFA/DCM is kept sufficiently short， Adpoc (or Mtt) /OPp 组合也可应用于wang树脂。For peptides prepared on SASRIN，侧链修饰要等从树脂上裂解之后。

X, Y = protecting groupsZ = O, yields得到 peptide acid
Z = NH, yields peptide amide
Pmc and Pbf最常用于保护精氨酸的胍基。裂解因巯基化合物的存在而加速。
Mtr group的裂解需奥较长的反应时间，并且需要较高的反应温度，因此会导致一些非预期的副反应。
The Trt and Mtt protected amino acids are perfectly suited for Fmoc based SPPS.
这些保护基增加Fmoc-Asn-OH and Fmoc-Gln-OH的溶解性。
在一般的Fmoc SPPS 中，侧链呗保护为tert.butyl ester，在合成条件下稳定，并且在最后的TFA裂解中易于离去。OPp, OAll esters在其他的正交保护使用，如on-resin环化，尤其这些酯可以再其他保护基如Boc, OtBu, Fmoc存在下裂解
Trt or Mtt是保护组氨酸咪唑环最好的保护基，在合成条件下稳定但是也不理想因为他们不能在活化过程 中完全抑制消旋。
Lysine赖氨酸 Boc 用于保护氨基，并在最终TFA裂解时脱去。也可用特殊的正交保护基，最常用的有Aloc，在Pd存在在下用亲核试剂裂解; Adpoc and Mtt 比boc更不稳定，重复用 1–2% TFA/DCM来裂解。The combination of the various Asp/Glu and Lys/Orn protecting groups has enabled the synthesis of complex molecules thanks to the “multidimensional orthogonality”.
Trt可用于保护丝氨酸和苏氨酸 如果需要on-resin衍生物的话
Tryptophan色氨酸 Trp不需要保护，但在最后TFA裂解时吲哚会发生烷基化。所以最好用Boc group保护一下。 在final TFA cleavage 裂解BOC过程中， Boc变为isobutylene，留下Nindole -carboxy 片段，随后用diluted AcOH来脱羰基。
Cy环己基、 Cys半胱氨酸 ，在 肽化学中需要特别注意，他有一个反常活泼的侧链巯基，常会在肽的合成结尾形成二硫键。 二硫键的行程可能存在于合成的很多阶段， on-resin 或者在溶液里。
脱除S保护及氧化得二硫键可以分开进行也可以同时进行，i.e. oxidative deprotection
如果要有连个或更多的二硫键形成，如果有成对的或正交的供选择是，则倾向于选择顺序的连续的二硫键或者是单个半胱氨酸保护基。所有的巯基都被释放出来，同时伴随着在包含氧化还原体系e.g.谷胱甘肽的缓冲溶液中进行桥连。这种方法呗称作oxidative folding。
空气氧化形成二硫键 肽溶解在10–3 to 10–4 M 稀醋酸溶液中或0.05 M 得醋酸铵中。调整pH在7.5 and 8 之间，室温下暴露空气搅拌。添加剂 1–10 % DMSO or 3% H2O2 可以加入来加速反应。（H2O2 不能在有Met的残渣时使用）接下来是HPLC，当二硫键形成之后，溶液用醋酸酸化，之后可以直接用于HPLC纯化。
在氧化四个自由的巯基时可能会出现错误配对的情况。适当的结合保护基，使的特定的裂解及使用最佳的环化条件得以应用。
Formation of Disulfide Bridges from Bis- 丙烯酰胺 Peptides
The peptide is dissolved at a concentration of 10–3 to 10–4 M in 40% aqueous acetic acid.
Iodine (25 to 50 fold excess) dissolved in 40% acetic acid (or in methanol) is added.
The solution is stirred at room temperature and the monitoring of the reaction is made by analytical HPLC.
At the end of the reaction the excess of iodine is destroyed with 1 M ascorbic acid抗坏血酸in water (the ascorbic acid solution is added up to disappearance of the iodine colour).
The solution is diluted with water to an acetic acid concentration of approximately 10% and is used directly for preparative HPLC purification.

Fmoc Based SPPS
基质功能化最常见方法：A.基质直接功能化，如chloromethylation；B. 与Linker联结 这是最普遍的方法
Linkers Linkers are bifunctional molecules anchoring the growing peptide to the insoluble carrier.
Linkers may be coupled to any carrier suitable for
SPPS, an important option if alternatives to polystyrene-based resins have to be considered.
The C-terminal Fmoc amino acid may be coupled to the linker yielding the so-called handle which can be purified before loading the polymer. High loads regardless of the bulkiness of the amino acid are obtained by coupling these handles.