食品中肉毒梭菌的PCR检测方法样本.doc

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食品中肉毒梭菌的ＰＣＲ检测方法
科标检测
1、 范围
本标准适用于食品中Ａ、 Ｂ、 Ｅ、 Ｆ型肉毒梭菌的检测。
   青岛科标检测研究院经过了山东省质量技术监督局( CMA) 和中国合格评定国家认可委员会( CNAS) 认证认可, 是权威的第三方检测机构。旗下科标生物实验室在微生物检测领域拥有丰富的经验, 能够针对食品、 医药、 化妆品、 农产品、 一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析, 为客户提供快速、 高效、 权威的第三方微生物检测服务, 保证产品质量安全, 专业得到了国内、 国际知名企业的广泛认可。能够按照各种标准提供微生物检测服务。
2、 规范性引用文件
ＧＢ／Ｔ４７８９．１２　食品卫生微生物学检验　肉毒梭菌及肉毒毒素检验
ＧＢ／Ｔ６６８２　分析试验室用水规格和实验方法
ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求
ＧＢ／Ｔ２７４０３　实验室质量控制规范　食品分子生物学检测
ＳＮ／Ｔ１１９３　基因检验实验室技术要求
3、 术语、 定义和略缩语
3.1肉毒梭菌　
肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌, 厌氧, 在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一类具有很强毒性的神经麻痹毒素, 即肉毒毒素。
3.2聚合酶链式反应
模板ＤＮＡ先经高温变性成为单链, 在ＤＮＡ聚合酶作用和适宜的反应条件下, 根据模板序列设计的两条引物分别与模板ＤＮＡ两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合, 接着在ＤＮＡ聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸( ｄＮＴＰ) 为底物, 使退火引物得以延伸, 然后不断重复变性、 退火和延伸这一循环, 使位于两段已知序列之间的ＤＮＡ片段呈几何倍数扩增。
3.3缩略语
Bp 碱基对
DNA 脱氧核糖核酸
dNTP 脱氧核苷三磷酸
dATP 脱氧腺苷三磷酸
dCTP 脱氧胞苷三磷酸
dGTP 脱氧鸟苷三磷酸
dTTP 脱氧胸苷三磷酸
Taq 水生栖热菌
Tris 三( 羟甲基) 氨基甲烷
EDTA 乙二胺四乙酸
4、 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全, 应由具备资格的工作人员检测肉毒梭菌, 所有培养物和废弃物应小心处理, 并按照ＧＢ１９４８９和ＧＢ／Ｔ２７４０３中的有关规定执行。
5、 防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照ＳＮ／Ｔ１１９３中的规定执行。
6、 方法提要
样品经增菌后划平板分离单菌落, 挑取可疑菌落到ＴＰＧＹ培养, 对培养物采用热裂解抽提ＤＮＡ法, 或商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒抽提ＤＮＡ法制备ＰＣＲ模板, 进行ＰＣＲ扩增, 琼脂糖凝胶电泳检验ＰＣＲ产物是否有特征条带, 从而对食品中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。
7、 设备和材料
7.1天平: 感量０．００１ｇ。
7.2生物安全柜。
7.3厌氧培养装置。
7.4恒温培养箱: ３５℃±１℃和２８℃±１℃。
7.5高压灭菌锅。
7.6恒温水浴: ３７℃±１℃和６０℃±１℃。
7.7速台式冷冻离心机: １４０００ｇ。
7.8冰箱: －２０℃和－７０℃。
7.9ＰＣＲ仪。
7.10电泳仪。
7.11凝胶成像分析系统。
7.12紫外分光光度计。
7.13微量可调移液器: ０．２μＬ～２μＬ、 ２μＬ～２０μＬ、 ２０μＬ～２００μＬ、 １００μＬ～１０００μＬ。
7.14离心管: １．５ｍＬ。
7.15ＰＣＲ反应管: ２００μＬ～５００μＬ。
8、 培养基和试剂
除另有规定外, 试剂为分析纯或生化试剂, 水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。
8.1庖肉培养基
8.2胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤( ＴＰＧＹ)
8.3厌氧卵黄琼脂
8.4无水乙醇和９５％乙醇
8.5ＰＢＳ缓冲液: 氯化钠７．６５０ｇ／Ｌ、 磷酸氢二钠０．７２４ｇ／Ｌ、 磷酸二氢钾０．２１０ｇ／Ｌ( ｐＨ７．４)
8.6ＴＥ缓冲液: １０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ( ｐＨ８．０) 、 １ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ( ｐＨ８．０)
8.7蛋白酶Ｋ溶液: 用ＴＥ配制, 使用浓度为１０ｍｇ／ｍＬ
8.8溶菌酶溶液: 用ＴＥ配制, 使用浓度为１０ｍｇ／ｍＬ
8.9３ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠溶液( ｐＨ５．２)
8.10２０％ＳＤＳ溶液
8.11引物: 根据附录Ｂ中表Ｂ．１的序列合成引物, 加超纯水配制成１００μｍｏｌ／Ｌ储液, 用于ＰＣＲ测试的引物浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ。
8.12TaqＤＮＡ聚合酶
8.13ｄＮＴＰ: ｄＡＴＰ、 ｄＴＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ。
8.14琼脂糖: 电泳级
8.15溴化乙锭
8.16ＤＮＡ分子量标准
8.17阳性对照: 含有扩增片段的质粒或Ａ、 Ｂ、 Ｅ、 Ｆ型肉毒梭菌的基因组ＤＮＡ
8.18商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒
8.19１０×ＰＣＲ缓冲液: ２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ( ｐＨ８．４) 、 ２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、 １５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。
8.20５×ＴＢＥ电泳缓冲液: Ｔｒｉｓ５４ｇ、 硼酸２７．５ｇ、 ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ( ｐＨ８．０) ２０ｍＬ, 加蒸馏水至１０００ｍＬ, 使用时稀释为０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液
8.21６×加样缓冲液: ３０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ, ３６％( 体积分数) 甘油, ０．０５％( 质量浓度) 二甲苯腈蓝ＦＦ, ０．０５％( 质量浓度) 溴酚蓝
9、 检验程序
检验程序见图１

10、 检验步骤
10.1样品制备和增菌培养
接种前, 先将增菌培养基煮沸１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ, 以排除溶解于培养基中的氧, 并迅速冷却, 切勿摇动。每１５ｍＬ增菌肉汤中接种１ｇ～２ｇ固体食品或１ｍＬ～２ｍＬ液体食品, 接种时将接种物慢慢接入肉汤液面以下。每份样品接种两管庖肉培养基, 置３５℃±１℃, 同时接种两管ＴＰＧＹ培养基, 置２８℃±１℃, 厌氧培养５ｄ。检查培养物的浊度、 产气、 肉粒的消化和产生的气味。若有生长, 按１０．２分离纯培养物。若未见生长, 则继续培养１０ｄ。
10.2分离纯培养物
取１ｍＬ～２ｍＬ培养液置于螺旋帽试管中, 加入等量过滤除菌的无水乙醇。混匀, 在室温下放置１ｈ。或８０℃加热１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ以破坏其繁殖体。
用接种环取１环～２环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种, 置厌氧条件下３５℃±１℃培养４８ｈ。
挑取约１０个单个的典型菌落。肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平, 光滑或粗糙, 容易蔓延生长并有不规则边缘。在卵黄培养基上用斜射光检查时, 菌落表面一般呈虹彩样, 亦称为珠色层。彩带一般向外延伸, 继而菌落产生不规则外形。
接种可疑菌落到ＴＰＧＹ培养基中, 置３５℃±１℃厌氧培养２４ｈ。
10.3模板ＤＮＡ的制备
以下两种方法任选一种进行。剩余培养液置４℃保存, 以备确证试验使用。
10.3.1热裂解抽提ＤＮＡ法
取１．４ｍＬＴＰＧＹ培养物转移至１．５ｍＬ离心管中, １４０００ｇ离心２ｍｉｎ, 弃去上清液。加入１．０ｍＬＰＢＳ悬浮菌体沉淀, １４０００ｇ离心２ｍｉｎ, 去上清。用４００μＬＰＢＳ重悬沉淀, 加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１００μＬ, ３７℃±１℃水浴１５ｍｉｎ, 期间每５ｍｉｎ～７ｍｉｎ颠倒混匀离心管。加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液１０μＬ, ６０℃±１℃水浴１ｈ, 期间每１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ颠倒混匀离心管。沸水浴１０ｍｉｎ, １４０００g离心２ｍｉｎ, 上清液转移至新的灭菌小离心管中。加入３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ溶液５０μＬ和９５％乙醇１．０ｍＬ, 颠倒混匀, －７０℃或－２０℃放置３０ｍｉｎ, １４０００ｇ１０ｍｉｎ, 弃去上清, 沉淀干燥后溶于２００μＬＴＥ溶液。按１０．４进行纯度和浓度测定后置于－２０℃保存。
10.3.2试剂盒抽提ＤＮＡ法
取１．４ｍＬＴＰＧＹ培养物转移至１．５ｍＬ离心管中, １４０００ｇ离心２ｍｉｎ, 弃去上清液。菌体沉淀用１．０ｍＬＴＥ缓冲液洗两次后重悬于１２０μＬ的２５％蔗糖溶液中。加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１２０μＬ, 混匀, ３７℃±１℃水浴３０ｍｉｎ; 然后加入２０％ＳＤＳ溶液３０μＬ, 轻轻混匀, 室温放置５ｍｉｎ; 再加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液９．０μＬ, 混匀后３７℃±１℃水浴３０ｍｉｎ。悬浮液采用商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取ＤＮＡ, 使用时按照试剂盒说明书进行操作。提取的ＤＮＡ按１０．４进行纯度和浓度测定后置于－２０℃保存。
10.4核酸纯度和浓度的测定
取适量ＤＮＡ溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后, 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值。ＤＮＡ的浓度按照式( １) 计算。
C＝Ａ260×Ｎ×５０……………………( １)
式中:
C——ＤＮＡ浓度, 单位为微克每毫升( μｇ／ｍＬ) ;
Ａ260——２６０ｎｍ处的吸光值;
Ｎ——核酸稀释倍数。
当浓度为０．３４μｇ／ｍＬ～３４０μｇ／ｍＬ, Ａ260／Ａ280比值在１．７～１．９之间时, 适宜于ＰＣＲ扩增。
10.5ＰＣＲ扩增
10.5.1采用分别针对Ａ、 Ｂ、 Ｅ、 Ｆ型肉毒梭菌肉毒毒素基因设计的型特异性引物, 进行多个ＰＣＲ扩增, 每个ＰＣＲ反应管检测一种类型的肉毒梭菌。
10.5.2ＰＣＲ反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。
10.5.3ＰＣＲ检测时反应体系应设置阳性对照、 阴性对照和空白对照。用含有扩增片段的质粒或Ａ、 Ｂ、 Ｅ、 Ｆ型肉毒梭菌的基因组ＤＮＡ作阳性对照, 用非肉毒梭菌基因组ＤＮＡ作阴性对照, 用无菌水作空白对照。
10.6凝胶电泳检测ＰＣＲ产物
用０．５×ＴＢＥ缓冲液制备１．２％～１．５％( 质量浓度) 的琼脂糖凝胶( 凝胶加热融化后冷却至６０℃左右加入溴化乙锭至０．５μｇ／ｍＬ, 或者在电泳后用０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭溶液进行染色) , 将１０μＬ的ＰＣＲ产物与２．０μＬ６×加样缓冲液混合, 点样, 其中一孔加入ＤＮＡ分子量标准, 以判断ＰＣＲ产物的片段大小。０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液, １０Ｖ／ｃｍ恒压电泳, 电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定, 电泳检测结果用凝胶成像系统记录。
11、 ＰＣＲ结果判定
阴性对照和空白对照均未出现条带, 阳性对照出现预期大小的扩增条带, 待测样品出现预期大小的扩增条带, 判定为ＰＣＲ结果阳性, 按第１２章进行确证试验; 待测样品未出现预期大小的扩增条带, 判定ＰＣＲ结果为阴性, 按第１３章直接报告结果。
实验中设置的阴性对照、 空白对照和阳性对照ＰＣＲ检测结果应符合上述情况。否则, 任一种对照如果出现非上述正常结果, 应重做实验。
12、 确证试验
取１０．３剩余培养液, 按ＧＢ／Ｔ４７８９．１２规定的方法进行确证试验。
13、 结果报告
ＰＣＲ结果阴性, 直接报告”未检出Ａ、 Ｂ、 Ｅ、 Ｆ型肉毒梭菌”。
确证试验结果为检出肉毒梭菌, 则报告”检出某型( Ａ、 Ｂ、 Ｅ、 Ｆ型) 肉毒梭菌”。
确证试验结果为未检出肉毒梭菌, 则报告”未检出Ａ、 Ｂ、 Ｅ、 Ｆ型肉毒梭菌”。

附　录　A
( 规范性附录)
培养基和试剂的配制
A.1　庖肉培养基
A.1.1成分
新鲜牛肉 ５００．０ｇ
蛋白胨 ３０．０ｇ
酵母浸膏 ５．０ｇ
磷酸二氢钠 ５．０ｇ
葡萄糖 ３．０ｇ
可溶性淀粉 ２．０ｇ
蒸馏水 １０００ｍＬ
A.1.2制法
将新鲜除脂肪和筋膜的牛肉５００ｇ切碎, 加入蒸馏水。加热至沸点, 再以文火煮１ｈ。充分冷却, 经纱布过滤, 挤出余液。加入其它成分, 用蒸馏水将液体体积补足至１０００ｍＬ。调节ｐＨ 至７．４±０．１, 经粗滤纸过滤。在１５ｍｍ×１５０ｍｍ 试管中先加入碎肉渣至３ｃｍ高, 然后加入肉汤, 超过肉渣表面约４ｃｍ, 上面覆盖一层液体石蜡, 厚度为０．３ｃｍ～０．４ｃｍ。在１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ。
A.2 胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤( TPGY)
A.2.1成分
胰酪胨 ５０．０ｇ
蛋白胨 ５．０ｇ
酵母浸膏 ２０．０ｇ
葡萄糖 ４．０ｇ
硫乙醇酸钠 １．０ｇ
蒸馏水 １０００ｍＬ
A.2.2制法
将固体成分溶于１０００ｍＬ蒸馏水中, 再分装１５ｍｍ×１５０ｍｍ试管, 每管１５ｍＬ。上面覆盖一层液体石蜡, 厚度为０．３ｃｍ～０．４ｃｍ。在１２１℃下高压灭菌１０ｍｉｎ。最终ｐＨ为７．０±０．１。放冰箱内保存, 若２周内不用则弃掉。临用前, 将基础液用蒸汽或煮沸加热１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ, 以排除游离氧, 迅速冷却。 　
A.3厌氧卵黄琼脂
A.3.1琼脂基础
酵母浸膏 ５０．０ｇ
胰胨 ５．０ｇ
蛋白胨 ２０．０ｇ
氯化钠 ５．０ｇ
琼脂 ２０．０ｇ
蒸馏水 １０００ｍＬ
在１２１℃下高压灭菌１５ｍｉｎ。最终ｐ Ｈ 为７．０±０．２。
A.3.2卵黄乳状液
用硬刷洗刷２个～３个鸡蛋, 沥干。将鸡蛋放在０．１％氯化汞溶液中浸泡１ｈ, 再用７０％乙醇浸泡３０ｍｉｎ。取出鸡蛋, 以无菌操作打开, 弃去蛋白。用注射器取出蛋黄, 放入灭菌容器, 加等量灭菌生理盐水,充分混合, 存于４℃备用。
A.3.3制法
每５００ｍＬ琼脂基础液( ４８℃～５０℃) 加８０ｍＬ卵黄乳状液, 充分混合, 制成平板。室温放置２ｄ, 或３５℃放置２４ｈ。剔除污染的平板, 将无菌平板存于冰箱。

附　录 B
( 规范性附录)
肉毒梭菌ＰＣＲ检测方法参照表
表 B.1肉毒梭菌肉毒毒素基因ＰＣＲ检测的引物序列
检测肉毒梭菌类型
引　物　序　列
扩增长度／ｂｐ
Ａ型
正: ５’-ＧＴＧ ＡＴＡ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＧＴ ＴＡＴ ＡＧ-３’
反: ５’-ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＧＴＣ ＣＣＡ ＡＴＴ ＡＴＴ ＡＡＣ ＴＴＴ-３’
983
Ｂ型
正: ５’-ＧＡＧ ＡＴＧ ＴＴＴ ＧＴＧ ＡＡＴ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＴＣ ＣＡＧ-３’
反: ５’-ＧＴＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＴＴＡ ＡＴＡ ＴＣＡ ＡＧＧ ＣＴＧ Ｇ-３’
492
Ｅ型
正: ５’-ＣＣＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＧＴ ＣＡＡ ＧＡＡ ＴＴＴ ＴＡＴ-３’
反: ５’-ＴＣＡ ＡＡＴ ＡＡＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＣＣＣ-３’
410
Ｆ型
正: ５’-ＧＣＴ ＴＣＡ ＴＴＡ ＡＡＧ ＡＡＣ ＧＧＡ ＡＧＣ ＡＧＴ ＧＣＴ-３’反: ５’-ＧＴＧ ＧＣＧ ＣＣＴ ＴＴＧ ＴＡＣ ＣＴＴ ＴＴＣ ＴＡＧ Ｇ-３’
1137

表 B.2肉毒梭菌肉毒毒素基因ＰＣＲ检测的反应体系
试剂
终浓度
加入体积／μＬ
10×ＰＣＲ缓冲液
1 ×
5.0
25ｍｍｏｌ／Ｌ MgCl2
2.5ｍｍｏｌ／ Ｌ
5.0
10ｍｍｏｌ／Ｌ dNTPs
0.2ｍｍｏｌ／ Ｌ
1.0
10 μｍｏｌ／Ｌ正向引物
0.5μｍｏｌ／ Ｌ
2.5
10 μｍｏｌ／Ｌ反向引物
0.5μｍｏｌ／ Ｌ
2.5
5U／μＬ Taq酶
0.05 U／ μＬ
0.5
DNA模板
-
1.0
DdH2O
-
32.5
总体积
-
50.0
注: 反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。

表 B.3肉毒梭菌肉毒毒素基因ＰＣＲ检测的反应参数
预变性
扩增
循环数
后延伸
95℃,5min
94℃,1min; 60℃,1min; 72℃,1min
40
72℃, 10min
注: ＰＣＲ反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。

科标检测-生物实验室: 提供食品微生物的各项检测服务。