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第二部分 生物药物制备实验

第一节 氨基酸及其衍生物类药物

实验二十二 固定化细胞法生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸
注: 此实验来自项目固定化细胞生产天冬氨酸, 丙氨酸( 国家攻关课题) 的成果
【实验目的】
1．学习L-天冬氨酸和L-丙氨酸的制备方法。
2．了解酶法生产这两种氨基酸的原理和细胞固定化的原理及优点。
3．掌握固定化细胞的技术。

【实验原理】
固定化细胞( Immobilized cell) 技术, 就是利用物理或化学手段将游离的微生物细胞、 动物细胞, 定位于限定的空间领域, 并使其保持活性且能重复利用的一项技术。
固定化细胞的制备方法主要有以下几种: 吸附法、 共价交联法、 絮凝法、 包埋法; 交联能够是细胞经过离子相互作用或共价连接到一个表面, 也能够是细胞与细胞之间用过天然或化学试剂诱导产生连接; 吸附法是细胞经过静电相互作用( 范德华力、 离子键和氢键) 吸附到支持物表面, 此法简单价廉, 但经常发现有细胞泄露; 絮凝法是利用某些微生物细胞具有絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法; 包埋法是近年来发展迅速的一种新兴固定化细胞技术, 它是将细胞捕获在一个保护性基质结构或胶囊中, 减少了细胞泄露, 因此具有操作简单, 对细胞活性影响较小, 效率高等特点, 是当前细胞固定化研究和应用最广泛的方法之一。
L-天冬氨酸( L-Aspartic acid) 是天然存在的重要氨基酸, 在食品、 医药、 日用化工、 纺织等行业有着广泛的应用。L-天门冬氨酸钾、 镁盐在细胞代谢中起着重要作用, 是钾、 镁的有效补充剂, 适用于各种心脏病。在食品方面, L-天冬氨酸作为食品添加剂可改进食品风味, L-天冬氨酸与D-丙氨酸可合成L-天冬酰-D-丙氨酸甲酯( 其甜度为蔗糖的150倍) , 是一种新型甜味剂。在化工方面, L-天冬氨酸还能够作为制造合成树脂的原料, 其衍生物还能够合成量型表面活性剂以及制造化妆品。
工业上生产L-天冬氨酸以往采用化学合成法和微生物发酵法随着固定化酶和固定化细胞技术的不断完善和发展, 人们开始改用含有天冬氨酸酶的固定化细胞直接将延胡索酸铵转化成L-天冬氨酸来实现工业化生产。
L-丙氨酸( L-Alanine) 是一种脂肪族的非极性氨基酸, 是丙酮酸代谢体系的非必须氨基酸, 在血液中含量最多, 与糖代谢密切相关, 使转氨反应中重要的氨基供体, 具有重要的生理功能; 同时又是一种重要的氨基酸类药物, 为多种复方氨基酸输液的重要组成成分, 并可作多种医药中间体。
本实验用卡拉胶包埋天冬氨酸酶产生菌和L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌制成固定化细胞, 利用生物反应器, 可连续生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸。

【实验材料】
1．器材
( 1) 水浴振摇培养箱 1台
( 2) 磁力搅拌器 1台
( 3) HPLC 1台
( 4) 三角烧瓶 250 ml 5个
( 5) 抽滤瓶 1个
( 6) 离心机 1台
( 7) 布式漏斗 2只
( 8) 恒温水浴锅 1台
( 9) 酶柱 1根
( 10) 烧杯 1 000ml 1个
( 11) 烧杯 500ml 2个
( 12) 烧杯 250ml 2个
( 13) 超级恒温水浴 1台
( 14) 恒流泵 1台
( 15) 高压灭菌锅 1个
( 16) 锋利小刀 1把
( 17) 试管 12支
2．试剂
( 1) 菌种
( 2) 玉米浆
( 3) 延胡索酸铵
( 4) PLP( 5-磷酸吡哆醛)
( 5) 牛肉浸膏
( 6) KH2PO4
( 7) MgSO4·7H2O
( 8) 浓氨水
( 9) 氯化钾
( 10) 氯化镁
( 11) 浓硫酸
( 12) 95％乙醇
( 13) Ｌ-天冬氨酸标准品
( 14) 延胡索酸标准品
( 15) Ｌ-丙氨酸标准品

【实验方法】
1．细菌的培养及菌体制备
接种1ml对数生长期天冬氨酸酶产生菌种至250ml三角烧瓶中, 内含50ml已经灭菌的培养基(1%延胡索酸铵, 2%玉米浆, 2%牛肉浸膏, 0.5%KH2PO4, 0.05%MgSO4•7H2O, pH7.0), 37℃振摇培养24h, 培养液离心( 3 000r/min, 20min) 倾出上清液, 再用生理盐水洗涤1次, 离心收集菌体, 置冰箱备用。
接种1ml对数生长期L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌种至250ml三角烧瓶中, 内含50ml已灭菌的培养基( 1.5%L-谷氨酸钠, 0.5%富马酸铵, 1%富马酸钠, 3.0%玉米浆, 2%蛋白胨, 0.05% KH2PO4, 0.01%MgSO4•7H2O, pH7.0) , 37℃振摇培养24h, 培养液离心( 3 000r/min, 20min) 倾出上清液, 再用生理盐水洗涤一次, 离心收集菌体, 置冰箱备用。
2．固定化细胞的制备
( 1) 天冬氨酸酶产生菌的固定化
将4g湿菌体悬浮于4ml生理盐水中, 置45℃恒温水浴保温, 0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中, 加热至70-80℃使之溶解, 再降温至45℃, 两者于45℃混匀, 混合物置4℃冰箱放置30min, 将凝胶在100ml 0.3mol/L KCl溶液中浸泡4h, 然后切成3mm×3mm×3mm的立方体颗粒。经生理盐水洗涤后, 将固定化细胞置于1mol/L延胡索酸铵中, 于37℃活化24h, 即可使用。

( 2) L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的固定化
将5g湿菌体悬浮于5ml生理盐水中, 置45℃恒温水浴保温, 0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中, 加热至70-80℃使之溶解, 降温至45℃, 两者于45℃混匀, 混合物置4℃冰箱放置30min, 将凝胶在100ml 0.3mol/L KCl溶液中浸泡4h, 然后切成3mm×3mm×3mm的立方体颗粒。用0.1mol/L甘氨酸充分洗涤, 在1mol/L天冬氨酸铵( 含0.1mol/LPLP) 底物中, 于37℃活化24h, 即可使用。
3．酶活力测定
( 1) 湿菌体天冬氨酸酶活力的测定
取0.5g湿细胞悬浮于2ml蒸馏水中, 加入30ml 1.0mol/L延胡索酸铵, 内含1mmol/L MgCl2, 1%Triton pH 9.0, 37℃搅拌反应30min, 煮沸终止反应, 1200rpm,5min离心后, 稀释反应上清液于240nm处测定吸收值, 按延胡索酸残余量计算酶活力, 一个酶活力单位定义为在测定条件下, 每小时每克细胞转化生成1µmol天冬氨酸所需的酶量。
( 2) 固定化细胞的天冬氨酸酶活力的测定
取相当于0.5g天然细胞的固定化细胞, 置于30ml 1.0mol/L延胡索酸铵, 内含1mmol/L MgCl2, 37℃搅拌反应30min, 迅速过滤除去固定化细胞, 分离反应液, 经稀释后于240nm处测定延胡索酸残余量, 并计算每克固定化细胞的酶表现活力。总活力用每克固定化细胞, 单位小时内所产生的L-天冬氨酸的微摩尔数表示( µmol/h·g·cell) 。
( 3) 延胡索酸( 即富马酸) 标准曲线的绘制
延胡索酸在240nm处有特征峰吸收, 在一定范围内与延胡索酸含量成线性关系, 且反应系统中无干扰。
标准曲线的绘制
试管号
1
2
3
4
5
6
延胡索酸标准液( 50µg/ml)
0
1
2
3
4
5
蒸馏水
5
4
3
2
1
0
OD240nm

根据测定的吸收值 作出标准曲线或回归方程。
( 4) 湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力的测定
取1g湿菌体悬浮于10ml生理盐水中, 取0.5ml悬浮液, 加入含0.1mmol/L PLP的1mol/L天冬氨酸铵的底物2ml( pH6.0) 于37℃反应30min, 煮沸终止反应。生成的L-丙氨酸用纸层析法定量测定。
展开剂选用正丁醇:醋酸:水=4:1:1, 显色剂用0.5%茚三酮溶液, 烘干后, 将显色斑点剪下用0.1%CuSO4·5H2O:75%乙醇=2:38洗脱后, 于520nm处比色, 再从标准曲线上读得L-丙氨酸的含量。L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力的的定义为: 每克细胞每小时生成1µmol /L-丙氨酸为1个酶活力单位( U) 。
( 5) 固定化细胞的L-天冬氨酸β-脱羧酶活力的测定
取6g固定化细胞( 相当于1g的湿细胞) 加入20ml生理盐水, 于37℃保温, 加入含0.1mmol/L PLP的1mol/L L-天冬氨酸铵4ml, pH6.0, 于37℃反应30min, 迅速过滤除去固定化细胞, 分离反应液, 生成的L-丙氨酸用纸层析法定量测定。
( 6) L-丙氨酸标准曲线的绘制
按( 5) 法用纸层析法定量测定L-丙氨酸的含量与显色斑点脱色后在520nm处比色的关系。
标准曲线的绘制
试管号
1
2
3
4
5
6
L-丙氨酸标准液( 40µg/ml)
0
1
2
3
4
5
蒸馏水
5
4
3
2
1
0
OD520nm

根据测定的吸收值, 作出标准曲线或回归方程。
4．L-丙氨酸的制备
分别将6g天冬氨酸酶和L-天冬氨酸β-脱羧酶的固定化细胞装入带夹套的固定化生物反应器内( Φ1.5cm×30cm) , 1.0mol/L延胡索酸铵( 含1mmol/L MgCl2, pH9.0) 底物, 以恒流速度经过天冬氨酸酶固定化细胞柱, SV=0.87h-1, 然后将流出液经过L-天冬氨酸β-脱羧酶固定化细胞柱, 并加0.1mmol/L PLP和28%的氨水, 使pH6.0, 流出液用纸层析法计算L-丙氨酸的量, 并计算转化率( L-丙氨酸转化率=L-丙氨酸浓度/延胡索酸铵浓度×100%) 。

【思考题】
１．分别求出湿菌体天冬氨酸酶活力、 固定化细胞的天冬氨酸酶活力及湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力、 固定化细胞的L-天冬氨酸β-脱羧酶活力。
２． 分别求出两种菌体包埋后的活力回收率。
３．分别求出L-天冬氨酸和L-丙氨酸的转化率。

第二节 多肽及蛋白质类药物

实验二十三 重组水蛭素Ⅲ的制备
注: 此实验内容来自校企合作课题, 部分成果已申请专利

【实验目的】
1．了解以基因工程菌种E.coli/pHV3为材料进行工程菌发酵培养、 外分泌表示小分子多肽类药物重组水蛭素Ⅲ及表示蛋白制备和抗凝血酶活力测定、 SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理。
2．掌握基因工程菌发酵培养条件、 分泌表示目的蛋白及表示蛋白分析鉴定的操作技术方法。

【实验原理】
水蛭素(hirudin)是一类由医用水蛭(Hirudo)唾液腺中分泌出的低分子量的酸性单链多肽, 19 , Markwardt首先将其分离纯化, 并于1970年确定它是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂, 即使在较低的浓度也可充分地阻止血液的凝固。药理学及临床研究表明, 水蛭素能有效地预防静动脉血栓的形成及弥散性血管凝结, 不引起过敏、 免疫反应, 不会造成循环功能障碍。可用于治疗不稳定性心绞痛(USA)、 急性心肌梗死(AMI)、 血管成形术、 术后血栓形成、 血液透析、 体外循环、 弥散性血管内凝血(DIC)等, 是很好的抗凝抗栓药物。
水蛭素的分子质量约为7 000Da, 含有65～66个氨基酸残基, 水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用, 其N端的3个二硫键则是决定分子二级和三级结构及其稳定性的关键, 将二硫键氧化, 或分子发生蛋白降解, 则失去抗凝活性。若Ｃ端羧基被酯化, 或失去Ｃ端氨基酸, 也会失去与凝血酶结合的能力。
水蛭素干燥状态下稳定, 室温下水中可稳定存在6个月, 80℃下加热15 min不被破坏。pH值升高则稳定性下降, 在0.1 mol/L盐酸溶液或0.1 mol/L氢氧化钠溶液中可稳定15 min。水蛭素不被胰蛋白酶水解, 对α-糜蛋白酶也有一定的耐受性, 但番木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。
由于天然水蛭素来源非常困难, 每条水蛭只含20μg的水蛭素, 不能满足临床应用。为此, 国外多家公司及研究单位从80年代末就开始研究采用基因工程技术生产重组水蛭素。当前, 在国外已上市的水蛭素产品有Hoechs公司的重组水蛭素(Lepirudin,商品名Refludon), Novartis公司的重组水蛭素产品Desirudin)。1997年, 本院合成了重组水蛭素Ⅲ基因并构建了大肠杆菌外分泌表示体系, 分泌型重组水蛭素Ⅲ基因工程菌的表示产物重组水蛭素Ⅲ( recombine hirudin Ⅲ, 简写为rHV3) 相对分子质量为7 010.8Da。
此工程菌为外分泌表示体系, 其基因表示产物rHV3易于纯化。但该表示系统会产生一些杂质蛋白和色素, 影响下游的分离纯化。提取纯化工艺采用了大孔吸附树脂疏水层析和离子交换层析方法较好地解决了杂质蛋白和色素的分离。大孔吸附树脂作为rHV3的第一个提取步骤, 高分子量杂蛋白被基本去除, 而离子交换则是去色素的关键。吸附及离子交换时采用合适的洗脱条件是提高活力收率的重要因素。该纯化方法工艺简单、 rHV3收率和纯度均较高, 适用于rHV3的大规模制备。
本实验以此工程菌为材料, 先进行工程菌发酵培养, 再将发酵液经离心, 从工程菌发酵液上清中分离纯化rHV3。发酵上清液经过大孔吸附树脂HP20处理后, 用DEAE-52阴离子纤维素交换层析, 得到较高纯度表示产物rHV3。rHV3进行抗凝血酶活力分析和15%SDS-PAGE电泳分析。rHV3生物活性的测定参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行。比活力测定方法为: 精确称取纯化产物10mg, 溶解于1 ml H2O中, 采用Lowry法测定蛋白质含量, 并测定抗凝血酶活力, rHV3比活力=抗凝活力(ATU)/蛋白含量。

【实验材料】
1．器材
( 1) 玻璃层析柱: 1.6 cm×20cm或/和2.6 cm×40cm 1套
( 2) 恒流泵 1台
( 3) 自动部分收集器 1台
( 4) 记录仪 1台
( 5) 恒温水浴锅 1台
( 6) 高速台式离心机 1台
( 7) 冷冻离心机 1台
( 8) 旋涡混合器 1台
( 9) 752紫外分光光度计 1台
( 10) 稳压电泳仪 1台
( 11) 摇床 1台
( 12) 垂直板式电泳槽 1套
( 13) 电炉 1只
( 14) 秒表 1只
( 15) 高压灭菌锅 1台
( 16) 电磁搅拌器 1台
( 17) 酸度计 1台
( 18) 发酵罐 1台
( 19) 微量移液器( 20μl, 200μl, 1 000μl) 各1支
( 20) 标准净化工作台 1台
( 21) 真空泵和真空干燥器 1套
( 22) 电子天平(精确到10mg) 1台
( 23) 照相器材 1套
( 24) 基因工程菌菌种: E.coli/pHV3为本实验室保存
( 25) 大孔吸附树脂HP20 若干
( 26) DEAE-52阴离子纤维素 若干
( 27) Eppendorf离心管架 1只
( 28) 96孔酶标板 1只
( 29) 脱色摇床 1台
( 30) 灭菌的移液器枪头 若干
( 31) 灭菌的Eppendorf管( 1.5ml微量离心管) 若干
( 32) 试剂瓶( 5 000 ml, 1 000 ml, 500 ml, 250 ml, 100 ml) 若干
( 33) 量筒( 2 000 ml, 1 000 ml, 100 ml, 10 ml) 各1只
( 34) 烧杯( 2 000 ml, 1 000 ml, 500 ml, 250 ml, 50 ml) 各3只
( 35) 布氏漏斗( 8 cm 1只) 和吸滤瓶( 1 000 ml) 各1只
( 36) 滤纸 若干
( 37) 玻棒 2根
( 38) 试管(5ml, 150支; 15ml, 16支)
( 39) 三角瓶( 250 ml) 2只
( 40) 大塑料桶 1只
( 41) 石英比色杯 1对
2．试剂
重组水蛭素Ⅲ制备和抗凝血酶活力:
( 1) 培养基:
种子培养基( LB 液体培养基) : 1% 胰蛋白胨( Tryptone) , 0.5% 酵母提取物( Yeast Extract) , 1% NaCl, 加蒸馏水配制, pH 7.0, 分装, 高压蒸汽( 1.03×105Pa) 灭菌20 min。接种前在无菌条件下加入抗生素, 氨苄青霉素的终浓度为100μg/ml。
发酵培养基: 1%蛋白胨, 0.5%酵母提取物, 4%谷氨酸钠, 10%麦芽汁。pH6.5, 摇瓶装液量为12%;
( 2) 氨苄青霉素(Amp);
( 3) 0.5%牛血纤维蛋白原 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制;
( 4) 凝血酶溶液: 500 NIH单位加5 ml蒸馏水;
( 5) 低分子量标准蛋白(17. 5～94 K Da);
( 6) 20 mmol/L乙酸;
( 7) 盐酸;
( 8) 异丙醇;
( 9) 20 mmol/L哌嗪;
( 10) 氯化钠;
( 11) 三( 羟甲基) 胺基甲烷( Tris) ;
( 12) 乙醇;
( 13) 氢氧化钠;
( 14) 谷氨酸钠( 或含99%谷氨酸钠的味精) ;
15%SDS-PAGE电泳分析:

同实验九。

【实验方法】
1．工程菌发酵培养
( 1) 从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素(终浓度为60 μg/ml)的LB液体培养基中, 37℃, 摇床转速220r/min, 培养18h。
( 2) 摇瓶培养: 再按3%接种量转接于发酵培养基中, 37℃, 250 r/min, 30h, 离心收集上清。
( 3) 补料-批式发酵: 30L的发酵罐装入15L发酵培养基, 初始pH值为6.5, 121℃下灭菌20 min, 待温度降至37℃时加氨苄青霉素至最终浓度为60μg/ｍl, 接入种子液1 000ml, 37℃培养, 调节搅拌速度及通气量, 控制溶氧在10～20%, 经过补充酸、 碱物质控制pH在6.0～7.5, 同时经过流加葡萄糖或蛋白胨调节培养基中营养成分, 延长活力表示时间。培养9～16h。
2．重组水蛭素Ⅲ分离纯化制备
( 1) 发酵上清液制备
下罐后发酵液经12 000 r/min高速离心除去菌体, 收获发酵上清液。采用Lowry法和Markwardt的凝血酶滴定法分别检测目的蛋白重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS –PAGE电泳分析。计算收率。
( 2) 大孔吸附层析
大孔吸附树脂HP20处理装柱, 用20 mmol/L乙酸平衡。调节发酵上清液pH值至5.0～6.0, 于抽气泵中脱去气泡, 以1ml/min的流速将样品上柱。依次用20 mmol/L乙酸洗涤和50 mmol/L pH8.5 Tris-HCl洗涤, 再用含10～40%异丙醇的20 mmol/L乙酸梯度洗脱, 分部收集器收集, 1.5ml/min, 每管收集6ml, 测定每管的A280值和重组水蛭素Ⅲ活性, 绘制洗脱曲线。收集显示活性组分, 检测重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。
大孔吸附柱处理方法: 首先用蒸馏水漂洗, 去除漂浮的细小颗粒, 再用95%乙醇重复浸泡使其充分溶胀和初步除杂。然后用95%乙醇在布氏漏斗中淋洗至乙醇在254nm的紫外吸收值小于0.03为止。再用蒸馏水洗尽乙醇。最后分别用5%盐酸和5%氢氧化钠浸泡3h, 均分别洗至pH值为中性。
( 3) DEAE-52阴离子交换柱层析
DEAE-52阴离子纤维素柱经20 mmol/L哌嗪平衡。 大孔吸附层析产物液样品经10 mmol/L哌嗪调节至pH6.0后上样。用平衡缓冲液洗涤至基线平稳。再用含0.1～0.4 mol/L NaCl的20 mmol/L哌嗪(pH6.0) 溶液梯度洗脱, 分部收集器收集, 1.5ml/min, 每管收集6ml, 测定每管的A280值和重组水蛭素Ⅲ活性, 绘制洗脱曲线。收集显示活性组分, 冷冻干燥后即得高纯度的重组水蛭素Ⅲ冻干粉。检测重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS-PAGE电泳分析。计算收率。
3．重组水蛭素Ⅲ生物活性测定　
于酶标板小孔中加0.5% 牛血[0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)配制]200μl, 再加入重组水蛭素Ⅲ溶液10～100μl, 充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(100 NIH单位), 时间间隔为1 min, 若在1 min内纤维蛋白原发生凝固, 即说明已达滴定终点。由凝血酶的消耗量换算出重组水蛭素Ⅲ的单位数。由于水蛭素与凝血酶是1:1结合, 故每消耗一个凝血酶单位(NIH)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。
4．重组水蛭素Ⅲ比活力测定方法
精称纯化产物10mg, 溶解于1 ml H2O中, 采用Lowry法测定蛋白质含量, 并测定抗凝血酶活力, 经以下公式换算即得单位质量的rHV3比活力。rHV3比活力=抗凝活力(ATU)/蛋白含量。
5．15%SDS-PAGE电泳分析样品纯度
电泳方法同实验九。
( 1) 按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶, 浓度15％。
( 2) 将发酵液上清、 解吸液和离子交换洗脱液样品处理后, 进行15%SDS-PAGE电泳析。( 3) 电泳2～3h后, 取出凝胶, 用0.15%考马斯亮兰-R250进行染色。过夜后倾出染液, 不断脱色, 起初每20min换液1次, 1h后每小时换液1次, 直到区带明显, 画出电泳区带图谱。
6．结果处理
( 1) 用箭头图表示重组水蛭素Ⅲ制备的操作流程。
( 2) 绘制洗脱曲线。
( 3) 重组水蛭素Ⅲ的纯化过程分析

重组水蛭素Ⅲ的纯化过程分析
纯化步骤 总蛋白(mg) 总活力(ATU) 比活(ATU/mg) 纯化倍数 收率(%)
A.发酵上清液
B.大孔吸附层析
C.DEAE-52
纤维素柱层析

( 4) 电泳图谱分析

【思考题】
1．影响重组水蛭素Ⅲ纯度和收率的因素有哪些? 如何加以控制?
2．试说明电泳图谱, 并用电泳图谱判断所制得的重组水蛭素Ⅲ的纯度。
3．如何在原核内成功表示小分子多肽类药物而不被宿主内蛋白酶水解?
实验二十四 酸醇提取法制备猪胰岛素
注: 此实验内容来自校企合作课题

【实验目的】
1．学习胰岛素的制备方法
2．了解胰岛素的理化性质及其在制备方面的应用
3．掌握酸醇提取法制备猪胰岛素的技术

【实验原理】
胰岛素( insulin) 是动物胰腺中兰氏小岛β-细胞所分泌的一种动物激素, 在体内具有降低血液中葡萄糖含量和调节血糖平衡的作用。医疗上主要用于治疗糖尿病, 也是生化工程中作为研究蛋白质结构与功能的常见材料。胰岛素共51个氨基酸, 由A、 B两条肽链组成。A链含21个氨基酸, B链含30个氨基酸, 两条肽链之间借两个二硫键联结, A链的第6与第11位氨基酸之间也有一个二硫键。人胰岛素分子量为5 734Da, 等电点为pH5.6。在酸性环境( pH2.5～3.5) 较稳定, 在碱性溶液中极易失去活力, 可形成锌、 钴等胰岛素结晶。又由于其分子中酸性氨基酸较多, 可与碱性蛋白如鱼精蛋白等结合, 形成分子量大、 溶解度低的鱼精蛋白锌胰岛素。在显微镜下观察呈正方形或偏斜方形六面体结晶。胰岛素不溶于水和乙醇、 乙醚等有机溶剂, 但易溶于稀酸和稀碱的水溶液, 也能溶于酸性或碱性的稀乙醇和稀丙酮中。
胰岛素一般由动物脏器提取, 其生产方法有酸醇提取减压法、 分级提取锌沉淀法和磷酸钙凝胶、 DEAE-纤维素及离子交换树脂吸附法。本实验介绍酸醇提取减压浓缩法由猪胰提取胰岛素的方法。

【实验材料】
1．器材:
( 1) 组织捣碎机 1台
( 2) 布氏漏斗 10cm 1个
( 3) 抽滤瓶 1 000ml 1个
( 4) 抽气泵 1台
( 5) 剪刀 1把
( 6) 烧杯 400ml 2个
200ml 2个
100ml 1个
( 7) 纱布 25cm×25cm 1块
( 8) 玻璃棒( 大) 2根
玻璃棒( 小) 2根
( 9) 量筒 500ml 1只
100ml 1只
10ml 1只
( 10) 容量瓶 100ml 1只
( 11) 分液漏斗 250ml 1只
( 12) 离心机 1台
( 13) 真空干燥器及真空泵 1套
( 14) 温度计 100℃量程 1根
( 15) pH试纸 各种量程规格 1套
2．试剂:
( 1) 86％乙醇、 68％乙醇
( 2) 草酸
( 3) 6mol/L硫酸溶液
( 4) 浓氨水、 2mol/L氨水、 4mol/L氨水
( 5) 氯化钠
( 6) 冷丙酮
( 7) 20％、 6.5％醋酸锌溶液
( 8) 2％、 10％柠檬酸溶液
( 9) 0.01mol/L 盐酸
( 10) 0.1mol/L磷酸二氢钠溶液
( 11) 乙醚
( 12) 乙腈

【实验方法】
1．操作方法:
(1) 提取: 取冻胰块100g用匀浆机绞碎后加入2.3～2.6倍的86％乙醇(w/w), 5％冻胰重的草酸( 少许硫酸调至pH2.5～3.0) , 在10～15℃温度下搅拌提取3h。过滤或离心取上清, 滤渣再用l倍量68％乙醇和0.4％冻胰重的草酸及少许硫酸按上法提取2h, 同上法分离合并乙醇提取液。
(2) 碱化、 酸化: 提取液在不断搅拌下加入浓氨水调溶液pH为8.0～8.4( 液温10～15℃) , 立即压滤或离心除去碱性蛋白。澄清液及时加6M硫酸酸化至pH为3.4～3.8, 降温至0～5℃, 静置4h以上, 使酸性蛋白充分沉淀。
(3) 减压浓缩: 离心取上清液, 在30℃ 以下真空浓缩除去乙醇, 浓缩至浓缩液比重为1.04～1.06( 约为原来体积的1/9～l/10) 为止。
(4) 去脂、 盐析: 将浓缩液转入烧杯, 于10min内加热至50℃, 立即用冰盐水冷却降温至5℃, 转置分液漏斗静置3～4h, 使油层分离。分出下层清液( 上层油脂可用少量蒸馏水洗涤回收胰岛素) , 调pH为2.3～2.5, 于20～25℃在搅拌下加入23％ (W/V)固体氯化钠, 搅拌盐析, 静置数小时, 盐析物即为粗品胰岛素( 含水量约为40%) 。
(5) 精制:
① 除酸性蛋白: 取粗制胰岛素, 按其干重加入7倍量冰冷蒸馏水溶解 ( 7倍量水应包括粗制胰岛素中所含水量) , 再加入3倍量的冷丙酮( 按粗品计) 并用2mol/L氨水调节pH为4.2～4.3, 然后按耗用的2mol/L氨水量补加丙酮使溶液中水和丙酮的比例为7 : 3。充分搅拌后, 低温放置过夜, 使溶液冷至5℃以下, 次日在5℃以下用离心分离法或用布氏漏斗过滤法将沉淀分离。
② 锌沉淀: 在滤液中加入2mol/L氨水调pH到6.2～6.4, 按溶液体积加入3.6％醋酸锌溶液( 浓度为20％) , 再用2mol/L氨水调节使最终pH为6.0, 低温放置过夜, 次日用布氏漏斗过滤, 分离沉淀。
③ 结晶: 经丙酮脱水后按每克精品( 干重) 加入2％柠檬酸50ml、 6.5％醋酸锌2ml, 丙酮16m1, 并用冰水稀释至100ml, 置冰浴中速冷至5℃以下, 用2M氨水调pH8.0, 迅速过滤。滤液立即用10％柠檬酸溶液调pH6.0, 然后补加丙酮使整个溶液体系保持丙酮含量为l6%。在10℃下缓慢搅拌2～5h后放入3～5℃冰箱72h使之结晶, 前48h内需用玻璃棒间歇搅拌, 后24h静置不动这一步骤关系到结晶优劣, 须仔细操作。在显微镜下观察, 外形为正方形或扁斜方形六面体结晶。结晶离心收集, 并用毛刷小心刷去晶体上面所覆灰黄色无定形沉淀, 用蒸馏水或醋酸铵溶液洗涤, 再用丙酮、 乙醚脱水, 离心后, 在五氧化二磷真空干燥箱中干燥, 即得结晶胰岛素, 效价每毫克应在25单位以上。
(6) 检测: 取对照品及供试品适量, 分别加0.01mol/L 盐酸溶液制1ml中含40单位的溶液, 照高效液相色谱法试验, 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5µm); 柱温40℃; 以0.1mol/L磷酸二氢钠溶液( 用磷酸调节pH值为3.0) -乙腈(73:27)或适宜比例的混合液( 含0.1mol/L硫酸钠) 为流动相; 检测波长为214nm; 流速为1ml/min。取供试品溶液及对照品溶液各20μl 注入液相色谱仪, 记录主峰的保留时间, 供试品的主峰保留时间应与同种属对照品的主峰保留时间一致。
(7) 效价测定: 将效价确定的Insulin标准品用0.01mol/L盐酸液配制并稀释成40、 30、 20、 10、 1和0.5U/ml溶液。样品原料以0.01mol/L盐酸液配制并稀释成1.5mol/ml溶液进样测定。效价计算以主峰面积为纵坐标, Insulin浓度为横坐标进行线性回归, 计算而得。

【思考题】