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植物乳杆菌培养基的优化

李 达

发酵剂是影响发酵产品质量的关键因素, 它的制备需要有良好的增菌培养基, 使植物乳杆菌得以大量增殖, 从而使其在经过喷雾干燥、冷冻、冻干等处理后有足够的活菌数存活。因此优化植物乳杆菌增菌培养基是一项十分重要的基础研究工作。
植物乳杆菌是泡菜、发酵谷物、发酵肉制品等重要发酵剂的组成菌之一。植物乳杆菌K25分离于西藏灵菇中, 在对其进行研究时发现, 用MRS培养基培养该菌时, 菌落总数仅能达到6.7×107cfu·mL- 1 左右。菌液中活菌数的增加, 可以通过培养基的优化设计来实现, 因此需要对培养基进行优化, 提高菌液中活菌数的含量。本文旨在通过对植物乳杆菌的培养基进行优化, 从而获得活菌数较高的菌液, 为研制高活力的冷冻干燥发酵剂及其产品的开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验菌种
L. plantarum K25, 分离于西藏灵菇。
1.2 材料与设备
胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏为生化试剂; K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4和各种糖类均为分析纯。
722 型分光光度计、立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台、分析天平、DNG- 9240 型恒温鼓风干燥箱。
1.3 培养基及培养条件
活化和计数培养采用MRS 培养基, 蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、KH2PO4 2 g、柠檬酸三钠2 g、乙酸钠2 g、葡萄糖20 g、Tween 80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g, 用蒸馏水定容至1 L, 调pH 6.2~6.4, 121 ℃灭菌15min。
以MRS 培养基为基础, 按照试验设计添加不同生长因子, 接种量0.5%接入150 mL 液体培养基中, 37 ℃静置培养24 h
1.4 方法
1.4.1 不同碳源、氮源、磷源的选择
在MRS 液体培养基的基础上, 分别添加2%(w/v) 乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖作为不同碳源; 选择胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏, 分别加入2.5%( w/v) 作为的不同氮源; 分别加入0.2%( w/v) K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4 作为不同磷源, 其他组分均相同。在培养基中接入活化后植物乳杆菌, 在37 ℃的条件下培养24 h, 稀释10倍后, 在600 nm 条件下测定菌液OD 值, 以MRS培养基为对照, 比较其对植物乳杆菌生长的影响情况。
1.4.2 培养基的优化
采用正交试验设计优化碳源、氮源、磷源的用量, 因素水平如表1 所示。其中A 因素为蔗糖,B 因素为酵母膏, C 因素为KH2PO4, 测定菌液OD值。

表1 正交试验因素水平

水平
Level
因素Factor
A
B
C
1
1
2.0
0.1
2
2
2.5
0.2
3
3
3.0
0.3
1.4.3 OD 值测定
用722 型分光光度计, 将菌液稀释10 倍后,以相同条件下的未接菌的培养基做参比, 在600 nm下测定菌液吸光度。
1.4.4 菌落计数
以MRS 固体培养基为计数培养基, 采取适当的稀释倍数, 涂布于平板上, 37 ℃培养36~48 h后计数。
2 结果与分析
2.1 碳源对植物乳杆菌生长的影响
不同碳源乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖对植物乳杆菌的生长的影响结果见表2。
表2 不同碳源对植物乳杆菌生长的影响

种类
对照
乳糖
蔗糖
葡萄糖
果糖

吸光度（OD）
0.21
0.18
0.24
0.22
0.20

由表2 可以看出, 植物乳杆菌在蔗糖为碳源的培养基中生长, OD 值为0.24 明显高于对照, 这可能由于植物乳杆菌K25 分离于西藏灵菇中, 而灵菇中含有大量的葡萄糖和蔗糖, 其中蔗糖能更好的被植物乳杆菌利用, 并促进其生长。而在乳糖和果糖为碳源时OD 值分别是0.18和0.20, 低于其它碳源, 不适于植物乳杆菌的生长, 因此确定蔗糖是最佳碳源。
2.2 氮源对植物乳杆菌生长的影响
氮源采用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏, 牛肉膏, 以MRS 培养基为对照, 对植物乳杆菌的生长影响见表3。MRS 培养基中氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏, 由表3可以看出, 植物乳杆菌的生长在以酵母膏为单一氮源时, OD 值略高于对照, 明显高于植物乳杆菌在其它氮源中的生长可能是由于植物乳杆菌K25分离于西藏灵菇中, 所利用的氮源与酵母膏中所含有的氨基酸同源或是氨基酸组成相似; 植物乳杆菌在以胰蛋白胨和大豆蛋白胨为氮源时生长效果较差, OD 值仅为0.328 和0.338; 牛肉膏是MRS 培养基中的氮源, 单独添加时不利于植物乳杆菌的生长, 不能很好的促进菌种生长, 菌液的OD 值最低。

表3不同氮源对植物乳杆菌生长的影响

种类
对照
胰蛋白胨
大豆蛋白胨
酵母膏
牛肉膏
吸光度（OD）

0.39
0.328
0.338
0.47
0.316

2.3 磷源对植物乳杆菌生长的影响
磷源采用K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4,由表4 可以看出, 在K2HPO4 为磷源时植物乳杆菌的OD 值是最小值0.256, 可能是因为K2HPO4 的添加改变了培养基的pH, 不利于植物乳杆菌的生长;而以KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4 为磷源时OD 值相差不多, 都在0.3 左右; 原基本培养基中磷源即为KH2PO4, 作为生长因子能够很好的促进植物乳杆菌的生长, OD 值为0.38, 因此确定采用原培养基中的KH2PO4。

表4不同氮源对植物乳杆菌生长的影响

种类
对照
磷酸氢二钾
K2HPO4
磷酸二氢钾
KH2PO4
磷酸氢二钠
Na2HPO4
磷酸二氢钠
NaH2PO4
吸光度（OD）
0.39
0.256
0.31
0.28
0.38

2.4 植物乳杆菌培养基的优化
根据单因素试验的结果, 设计正交试验, 因素A、B、C 分别为蔗糖、酵母膏、KH2PO4, 以吸光值（OD600nm）为评价指标, 测定结果和相应的极差分析见表5.
由表5 可以看出, 各因素对植物乳杆菌的生长影响次序依次是: 蔗糖>KH2PO4> 酵母膏。蔗糖的添加量是影响指标值的最主要因素, 酵母膏添加量对指标值影响最小。

表5 正交试验因素水平

试验号
Trial number
因素Factor
OD600nm
A
B
C
1
1.0
2.0
0.1
0.347
2
1.0
2.5
0.2
0.586
3
1.0
3.0
0.3
0.135
4
2.0
2.0
0.2
0.744
5
2.0
2.5
0.3
0.755
6
2.0
3.0
0.1
0.836
7
3.0
2.0
0.1
0.743
8
3.0
2.5
0.3
0.687
9
3.0
3.0
0.2
0.735
K1
0.356
0.608
0.623

K2
0.778
0.676
0.688

K3
0.719
0.596
0.544

R
0.422
0.107
0.144

当蔗糖添加量为1%时, 不利于植物乳杆菌的生长, 随着蔗糖添加量的增加, 指标值明显增大, 但是添加量为3%时, 指标值下降, 说明过多的碳源并不利于植物乳杆菌的生长, 蔗糖添加量为2%时最好。KH2PO4 和酵母膏添加量过多或过少, 对植物乳杆菌的生长都不利, 最佳水平为A2B2C2 的组合。
3 结论
a. 适合植物乳杆菌生长的培养基中, 最佳碳源、氮源、磷源分别是蔗糖、酵母膏、KH2PO4。
b. 采用正交试验优化后植物乳杆菌培养基中各因素用量为酵母膏2.5%、蔗糖2%、KH2PO4 0.2%。
c. 优化后的植物乳杆菌的活菌数达3.0×108cfu·mL- 1, 为植物乳杆菌发酵剂的进一步研究奠定了基础。