SC∕T 7225-2017 草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法(水产).pdf

ICS 65.020.30 B 41 户:才H中华人民共和国水产行业标准SC/T 7225-2017 草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法Detection method by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for grass carp reovirus 2017 -06一2发布2017 -10-01实施中华人民共和国农业部发布乓刚吕本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业部渔业渔政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会CSACjTC156)归口。本标准起草单位:浙江省淡水水产研究所。SCj T 7225-2017 本标准主要起草人:沈锦玉、郝贵杰、潘晓艺、徐洋、袁雪梅、尹文林、姚嘉费、商凌云。I SC/ T 7225-2017 引本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到6.3中RT-LAMP引物与草鱼呼肠孤病毒I型H型囚型RT-LAMP可视化检测试剂盒及其检测方法)(专利号:201410683383.7)及草鱼呼肠孤病毒I型H型皿型RT-LAMP荧光检测试剂盒及其检测方法)(专利号:201410684920. X)等相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得:专利持有人:浙江省淡水水产研究所地址:浙江省湖州市吴兴区杭长桥南路999号请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。E SC/ T 7225-2017 草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法1 范围本标准描述了草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增检测的技术原理，规定了试剂和材料、器材和设备、操作步骤及结果判定。本标准适用于草鱼呼肠2 规范性引用文件下列文件对于本件。凡是不注日期3 缩略语AMV RdRp: RNA: RT-tion) 4 技术原理、分别根据草鱼外引物及环状引物RdRp基因序列启动互结果。5 试剂和材料1 amplifica 特异性内引物、环链置换反应，在过颜色变化观察判定5.1 水:应符合GB/T6682中一级水的要求;DEPC7j(自配(见附录B中B.l)或购买商品化产品。5. 2 阳性对照:各基因型病毒阳性组织、细胞培养物或含目的片段的RNA。5.3 RT-LAMP引物:引物分为A、B、C三组，A为基因I型，B为基因H型，C为基因皿型，序列参见附录A。各组引物10倍浓缩液浓度分别为:F3/B3 2mol/L、FIP/BIP16mol/L、LF/LB8mol/L; 引物浓缩液D为三组引物混合配置，浓度同A、B、C。一200C保存备用。5.4 Bst酶:一200C保存，酶浓度为8U/L，避免反复冻融。5.5 AMV酶:一200C保存，浓度为5U/L，避免反复冻融。5.6 10XThemoPol聚合酶缓冲液:一200C保存，含O.2 mol/ L Tris -HCl、O.1 mol/ L KCl、O.lmol/LSC;T 7225-2017 CNH4 )2S04 ,20 mmol/ L MgS04和1% Triton X -100。5. 7 硫酸镜溶液CMgS04):一200C保存，浓度为100mmol/ L。5. 8 甜菜碱:浓度为5mol/ L，一200C保存，避免反复冻融(见B.2)。5.9 dNTP: -200C保存，含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。5. 10 RT -LAMP反应密封液:购买商品化产品，一200C保存，无RNA酶的矿物油。5. 11 SYBR Green 1荧光染料溶液:一200C保存，10000X染料溶液。5. 12 磷酸盐缓冲液CPB曰:浓度0.01mol/L,pH 7.2，常温保存(见B.3)。5. 13 Trizol试剂:40C保存。5. 14 三氯甲皖:分析纯试剂，常温保存。5.15 异丙醇:分析纯试剂，使用前预冷至200C。5.16 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至200C。6 器材和设备6. 1 -20oC普通冰箱。6. 2 剪刀、慑子、解剖刀等解剖用具。6.3 无菌研钵或研磨棒。6.4 涡旋振荡器。6. 5 微量移液器和吸头。6. 6 台式高速冷冻离心机(最高转速15000r/ min)和离心管。6. 7 恒温金属浴或可控温水浴锅。6.8 计时器。6. 9 微波炉。6. 10 高压灭菌锅。7 操你步骤7.1 采样7.1.1 采样对象草鱼、青鱼等易感鱼类。7. 1.2 水温和数量应在养殖水温高于200C进行，采样数量应符合SC;T7103的要求。7. 1.3 样品采集按GB/T18088的规定执行。对有临床症状的鱼(参见附录C)，体长运二4cm的鱼去尾后取整条(尾)鱼，体长为4cm口1、.乌、白脑、肝、肾和脾。7. 2 样品的处理将样品置于冰冷的无菌研钵中匀浆，再用PBS配成1: 10乳悬液，冻融2次3次;然后，在40C条件下，以5000r/min离心10min，取上清液待检;若待检样品为病毒的细胞纯培养物，可直接抽提RNA检测。7. 3 设立对照每次扩增应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照以DEPC水代替RNA模板;阴性对照2 SC/T 7225-2017 以不含目的片段的RNA、正常组织或细胞提取物为模板;阳性对照以含目的片段的RNA、含靶病毒的组织或细胞提取物为模板。7. 4 RNA抽提7. 4. 1 取7.2中待检样品，用RNA提取试剂盒抽提，或按7.4. 27. 4. 5的方法处理。7. 4. 2 分别取200L待检样品匀浆上清液，加入1mL Trizol试剂，用枪头吹打10次20次，室温放置5min;加入200L三氯甲烧，涡旋振荡30s混匀，室温放置15mino 7.4.340C条件下，12000r/ min离心10min;取上层水相至一新的EP管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次棍匀，一200C放置20min。7. 4. 4 40C条件下，12000r/ min离心10min;弃上清液，沉淀用1mL 75%乙醇清洗;40C条件下，8000r/min离心10min，弃上清液，沉淀室温干燥5min。7. 4. 5 加20LDEPC7j(溶解RNA沉淀。一200C冰箱保存备用。若阳性对照、阴性对照为组织或细胞培养物，同法抽提RNA。7. 5 RT-LAMP扩增7.5. 1 反应体系草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP反应体系于冰上配制，根据表1和样品数N配置反应体系，之后，按每反应管分装23L反应液，并各管分别依次加人空白对照、阴性对照、检测样品和阳性对照，加入浓度为50ng/L250 ng/L的RNA模板2.0 L.1昆匀。表1逆转录环介导等温扩增反应体系配置(N=样晶数)组分t作液浓度加样量，L反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10X 2. 5X (N+3) 1X RT-LAMP引物10X 2.5X(N+3) 1X dNTPs 10 mmol/L 3. 5X (N+ 3) 1. 4 mmol/ L 甜菜碱5 mol/ L 2. OX (N+ 3) 0.4 mol/ L 硫酸续100 mmol/L 1.5X(N+3) 6 mmol/LC不包括缓冲液中所含Mg2+)Bst酶8 U/L 1. OX (N+ 3) 0.32 U/L AMV酶5 U/L 0.5 X(N+3) 0.1 U/L 水9. 5X (N+3) 检测草鱼呼肠孤病毒时采用引物浓缩液D进行RT-LAMP检测体系配制;对检测为1I日性的样品，需要区分草鱼呼肠孤病毒基因型时，应分别采用引物浓缩液A、引物浓缩液B、引物浓缩液C进行RTLAMP检测体系配制。7. 5. 2 反应条件恒温金属浴或可控温水浴锅中，650C反应40mino 7. 6 SYBR Green 1荧光染料染色将SYBRGreen 1荧光染料恪液用DEPC水稀释10倍后，分别取lL加至25L空白对照、阴性对照、阳性对照和待检样品LAMP扩增产物中，轻轻泪匀并在黑色背景下观察。8 结果判定8. 1 阳性结果判定采用引物D进行样品扩增(空白对照和阴性对照反应管液体应为橙色，阳性对照反应管液体应为绿色)，结果参考附录D的RT-LAMP产物检测图进行判定。检测样品反应管液体呈绿色，则判定检测样品草鱼呼肠孤病毒初筛日性;检测样品反应管液体呈橙色，则判定检测样品草鱼呼肠孤病毒初筛阴性。3 SC/T 7225-2017 8. 2 病毒基因型判定4 病毒基因型按以下方法判定:a) 采用引物浓缩、液A配制RT-LAMP检测体系，检测样品结果为阳性的，则判断检测样品草鱼呼肠孤病毒基因I型初筛阳性;b) 采用引物浓缩液B配制RT-LAMP检测体系，检测样品结果为阳性的，则判断检测样品草鱼呼肠孤病毒基因H型初筛阳性;c) 采用引物浓缩液C配制RT-LAMP检测体系，检测样品结果为阳性的，则判断检测样品草鱼呼肠孤病毒基因囚型初筛阳性;d) 若出现2种或3种RT-LAMP检测体系结果为阳性时，则判断检测样品对应的2种或3种基因型的草鱼呼肠孤病毒初筛阳性。SCjT 7225-2017 附录A(资料性附录)草鱼呼肠孤病毒RdRp基因序列A. 1 草鱼呼肠孤病毒基因I型RdRp基因部分序列(accessionNo. AF260512) 1471 GACGATTCCAAGGTCAAGAAGTCCTCCAAAATATATCAAGCCGCACAAATCGCTCGTATCGCATTTATGC 1541 TCCTAATCGCTGCCATCCACGCTGAAGTCACGATGGGTATTCGAAATCAAGTGCAACGTCGAGCACGCTC 1611 CATCATGCCTCTCAATGTCATTCAGCAAGCCATCTCCGCGCCTCATACCTTAGTCGCCAACTACATCAAT 1681 AAACACATGAACCTCTCCACCACCTCCGGTAGTGTTGTTACTGATAAGGTCATCCCTCTCATTCTCTACG 1751 CCTCCACCCCCCCCAACACTGTCGTCAACGTCGATATTAAAGCTTGCGACGCCTCCATCACTTACAATTA 注:下划线所示部分为RT-LAMP靶标扩增区域。A. 2 基因I型LAMP引物中碱基构成GCRV -1 -F3CS-3) :AATCGCTCGTATCGCATT GCRV -1 -B3CS-3): TGGTGGAGAGGTTCATGT GCRV -1 -FIPC S -3) : TGCTCGACGTTGCACTTGA TTTTCTCCT AA TCGCTGCCA TC GCRV -1 -BIPCS-3) :CGCTCCATCATGCCTCTCAATTTTTGATGTAGTTGGCGACTAAG GCRV-I-LF:CCATCGTGACTTCAGCGT GCRV-I-LB:TTCAGCAAGCCATCTCCG A. 3 草鱼呼肠孤病毒基因E型RdRp基因部分序列(accessionNo. GQ896335) 1961 GTAAGCAGAACATGGTACAGCATTTGGCACGTCTATACAAGAAGCCTTTTCAATACGACGTAAATGATCC 2031 ATTCTCACCCGGAAACAAATTTCAATTTGACACCACTGTCTTTCCCTCTGGTTCCACAGCAACGTCCACG 2101 GAGCATACCGCTAACAATAGCACCATGTTTGACTACTTCCTAACTCACTACGTACCACAGAACGCTCAAT 2171 CACCGACGCTTAAGCACATCGTGCGTGGTATGTCGATTCAGCGGAACTACGTATGTCAAGGAGATGATGG 2241 CATATGTATATTGGACCATTATGGTGGGAGGCGCGTGAGTAATGAGGACATAAACGAGTTCATCAAACTC 2311 CTCATAGACTACGGTGGACTATTCGGCTGGCGGTATGATATAGACTTCCACGGTAATGCCGAATTCCTTA 注:下划线所示部分为RT-LAMP靶标扩增区域。A.4 基因E型LAMP引物中碱基构成GCRV -1I-F3CS-3) :AAATGATCCA:CTCACCC GCRV -1I-B3C5-3) :CCACCATAATGGTCCAATATAC GCRV -1I-FIPCS -3) : GTGATTGAGCGTTCTGTGGTATTTTGAGCATACCGCTAACAATAG GCRV -1I-BIPC 5 -3) : TAAGCACATCGTGCGTGGTTTTTATGCCA:CATCTCCTTGA GCRV -1I-LF:CGTAGTGAG1AGGAAGTAG GCRV -1I-LB: TATGTCGA:寸CAGCGGAAC5 SC/ T 7225-2017 A.5 草鱼呼肠孤病毒基因E型RdRp基因部分序列(accessionNo. JN967630 ) 1611 GCCATTGAACATCGTGCAACAGACTGTATCCGCAATCCACACTATAGTCGCCGATTACATTAATAAACAT 1681 ATGAACTTGTCAACTACTAGCGGCAGTGCTGTGCAAGAGAAGGTCATACCATTGGTGCTTTTCGCATCCA 1751 CCACACCTACAACTGTTGTCAACGTCGATGTTAAAGCCTGTGATGCTTGTGTCACGTACAGTTACTTCCT 1821 ATCGGTCATCTGTGCAGCCATGTATGAGGGACTCAATCCACATGGGGATCCAAGACCGTTTATGGGCGTT 1891 CCCGTGCTGCCATACACGAACCGAGTATCCAGCGCTATGATGACCGATGAGGCCAGTGGTATGCAGGTCA 注:下划线所示部分为RT-LAMP靶标扩增区域。A.6 基因E型LAMP寻|物中耐基构成6 GCRV -III-F3C5仁3): TATCCGCAATCCACACfA GCRV -III-B3C5-3) :CCATAAACGGCTTGGATC GCRV -III-FIPC5二3): TAGGTGTGGTGGATGCGA寸TTTGAACTTGTCAACTACfAGCGCRV -III-BIPC5- 3) :ACfGTTGTCAA:;TCGATG11寸T1TGACCGATAGGAAGTAACfGCRV -III -LF: CCAATGGTATGACcrrCfcrr GCRV-皿-LB:CCfGTGATGCTTGTGTCA B. 1 DEPC7./ 附录B(规范性附录)试剂配制SC/ T 7225-2017 每升水中加入1mL DEPC，用力摇匀，使DEPC充分混匀在水中，370C放置12h，再经1210C15 min 高压灭菌并放气后备用。B.2 甜菜耐(5mol/L) 称取2.93g甜菜碱粉末，用5mL DEPC水溶解完全，再用直径为o.22m的一次性滤器过滤分装至5个EP管中，-20oC保存备用。B.3 磷酸盐缓冲液(PBS，O.01 mol/L,pH 7. 2) 每升蒸馆水中加人氯化铀8g、氯化饵0.2g、碳酸氢纳1.15 g、磷酸二氢伺0.2g，经1210C、15min 高压灭菌后备用。7 SC/T 7225-2017 附录C(资料性附录)草鱼出血病(Hemorrhagicdisease of grass carp) C1 病原学病原为草鱼呼肠孤病毒CGrasscarp reovirus，GCRV)，又称草鱼出血病病毒CGCHV)，属呼肠孤病毒科CReoviridae)刺突病毒亚科CSinareovirinae)水生呼肠孤病毒属CAquarevirus)水生呼肠孤病毒C群CAquareovirus C)成员。GCRV病毒粒子呈球状，直径70nm，有双层衣壳，无囊膜，含有11个双股RNA片段。目前已确定的病毒株有以873株为代表株的基因I型，以9014株为代表株的基因H型，以HGDRVC原为GCRV104株)为代表株的基因田型，3个毒株的核酸电泳罔谱、毒力和抗原性等方面都有所差别。GCRV靶器官是鱼肾，病毒感染导致鱼体免疫力下降。C2 流行病学本病主要流行于我国长江中下游以南广大地区，夏季北方也有该病流行报道。越南养殖流行的红点病，其流行水温和发病症状均与本病相似，很可能是同一疾病。病毒可感染青鱼、草鱼、麦穗鱼、链、编、僻、鲤等淡水鱼类，尤以体长2.5 cm15 cm的草鱼和1足龄青鱼易感。2龄以上草鱼和青鱼发病病例极少，症状也较轻，有的元具体的临床症状，但可携带病毒，成为传染源。本病主要发生于6月9月水温在200C300C的季节，尤以250C280C为流行高峰。在该季节也适宜细菌大量繁殖，将明显加重GVRC感染草鱼病情，死亡率可达70%以上。病毒污染水浸泡可使健康鱼感染，表明本病可经水平传播。也可通过寄生虫传播。C3 临床症状水温250C时，草鱼出血病潜伏期约为7d。病鱼体表发黑、眼突出，口腔、鲍盖、鲍和鳝条基部出血。解剖可见肌肉点状或块状出血、肠道出血;肝、脾和肾也可见不同程度出血，肝有时因失血而发黄。根据临床症状不同分为红肌肉红肠红蜡红鲍盖3种类型。患病鱼可出现1种症状或同时具有2种及以上的症状。8 RT-LAMP产物检测图见图0.1。说明-1一一阳性对照(寻|物D扩增); 2-一一阴性对照(引物D扩增); 3 引物D扩增阳性结果;4一一号|物A扩增阳性结果;2 附录D(资料性附录)RT-LAMP产物检测图3 4 5 6 5一一寻|物B扩增阳性结果;6一-引物C扩增阳性结果;7 7一一空向对照(寻|物D扩增)。图D.lRT-LAMP产物检测图SC/ T 7225-2017 9 sc 中华人民共和国水产行业标准草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT -LAMP)检测方法SC/ T 7225一2017兴* 争等中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址)中国农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销争等9导争等开本880mmX1230mm 1/16 印张l字数20千字2017年9月第1版2017年9月北京第1次印刷书号16109 4219 定价25.00元版权专有侵权必究举报电话[phone]