附子高压蒸制降毒工艺研究.doc

SHAANXI INSTITUTE OF INTERNATIONAL TRADE ＆ COMMERCE
本科生毕业论文（设计）

论文题目： 附子高压蒸制降毒工艺研究

院 (系）： 医药学院（药学系）
专 业： 药物制剂
学 号： 105058
姓 名： 何忠安
指导教师： 崔 於

二零一四年五月

郑 重 声 明

本人呈交的学位论文，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，所有数据、图片资料真实可靠。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含他人享有著作权的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确的方式标明。本学位论文的知识产权归属于培养单位。

本人签名： 日期：

摘 要
通过正交试验优选附子的高压蒸制工艺。以双酯型生物碱含量、总生物碱含量及外观质量为综合评价指标，系统研究加压蒸制工艺对附子中所含乌头碱类生物碱成分的影响，对高压蒸制时间、压力及水处理方式3个因素进行考察，采用L9(33)正交试验法优选附子的高压蒸制工艺，进一步优化附子炮制工艺，并研究该工艺的适用性。附子最佳高压蒸制工艺为A2B2C2，即附子经润湿法处理后，O.10MPa压力下蒸制150min。该优选的工艺简便、易行、可控，可作为代替附子传统炮制工艺的新方法。

关键词：附子；高压蒸制；正交设计；生物碱

Abstract
To optimize high pressure steaming process of aconitum carmichaelii. Orthogonal test was used to optimize high pressure steaming process of A.carmichaelii with appearance quality，the content of diester diterpenoid alkaloids and total alkaloid as comprehensive evaluation index，System study pressure steamed in the process of lateral root contains the influence of aconitine type alkaloids component,high pressure steaming time,pressure and softening way were selected as factors .Further optimization of the processing of lateral process, the applicability of the study of the process. 0ptimum high pressure steaming technology was A2B2C2，that of treated by wetting method，steamed 150 min at 0.10MPa． This optimized process was simple，practical and easy to control，it could be used as a new method to replace traditional processing technology of A．carmichaelii.

Key words: Aconitum carmichaelii；high pressure steaming；orthogonal design；alkaloid
目 录
1 绪 论 1
1.1 选题背景 1
1.2 选题意义 1
2 国内外发展状况 2
2.1 国外研究现状述评 2
2.1.1 附子及其制剂临床应用研究 2
2.2 国内研究现状述评 2
2.2.1 附子主要化学成分 3
2.2.2 附子炮制工艺及含量测定研究 3
2.2.3 附子配伍减毒增效 3
2.2.4 附子应用毒性控制 4
2.2.5 附子相关药理实验 4
3 研究内容 5
3.1 基源研究 5
3.2 产地加工 5
3.3 炮制方法研究 5
4 高压蒸制工艺研究 6
4.1 实验方法 6
4.1.1 实验材料及仪器 6
4.1.2 6种酯型生物碱的含量测定色谱条件 6
4.1.3 制备对照品溶液 6
4.1.4 供试品溶液制备 6
4.1.5 标准曲线的制备 7
4.1.6 精密度实验 7
4.1.7 稳定性实验 7
4.1.8 重复性实验 7
4.1.9 加样回收试验 8
4.1.10 样品测定 8
4.2 总生物碱的含量测定 8
4.3 高压蒸制工艺的优选 8
4.4 验证试验及炮制前后生物碱含量比较 10
5 结论 12
5.1 生物碱含量变化规律 12
5.2 黑顺片验证实验工艺 12
5.3 附子高压蒸制工艺的可行性 12
5.3 附子高压蒸制工艺的发展前景 12

参考文献 13
致谢 15

1 绪 论
1.1 选题背景
毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品，附子具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪的功效，被历代医家首肯。本课题已成功申报陕西省教育厅课题。
附子辛、甘，大热；有毒。归心、肾、脾经。具有回阳救逆，补火助阳，逐风寒湿邪的功能，用于亡阳虚脱、宫冷、心腹冷痛、虚寒吐泻、阴寒水肿、阳虚外感、寒湿痹痛。炮附子以温肾暖脾为主，用于心腹冷痛、虚寒吐泻。淡附子长于回阳救逆、散寒止痛，用于亡阳虚脱、肢冷脉微、阴寒水肿。《吴普本草》载“大毒”，《名医别录》载“有大毒”，说明古人对附子的毒性有充分的认识。生附子有毒，加工炮制后毒性降低，便于内服。产地加工盐附子的目的是防止药物腐烂，利于贮存。加工成黑顺片、白附片后毒性降低，可直接用药。
附子，分布于长江中、下游；北至秦岭和山东东部，南至广西北部，主产于四川 、陕西、安徽 、浙江、江苏，多为栽培品。附子在我国传统医学中应用广泛、历史悠久,早在《神农本草经》中就有附子的记载，《伤寒论》、《金匮要略》中的很多方剂也含附子，以后历代本草书中大多有附子的记载。现代药理研究表明附子具有以下作用：强心、抗心肌缺血缺氧、强心率、对抗缓慢型心律失常，抗炎，对中枢神经系统（镇痛），降糖，抗肿瘤、抗衰老等作用。
1.2 选题意义
附子所含的乌头碱等酯型生物碱既是有效成分，又是毒性成分，且安全范围小，有效的炮制可使双酯型生物碱水解成单酯型生物碱达到降毒存效的效果。目前还不能做到同时存在控制附子毒性和保存疗效的炮制工艺规范，同时未有文献表明附子安全性和有效性的质量标准[1]。2010年版《中国药典》中附子的制法为常压蒸法和煮法相结合，无具体工艺规范，该方法耗时耗能，需炮制人员凭经验来判断炮制终点，可控性较低，且炮制过程中有效成分损失严重。
本课题的研究对于附子炮制减毒存效具有一定的意义，可实现附子炮制生产的规范化，有效地提高附子药材的社会效益和经济效益，具有重要的现实意义。
2 国内外发展状况
2.1 国外研究现状述评
附子的主要成分为乌头碱，其中剧毒的双酯型生物碱为主要活性成分。因有很强的毒性，曾用多种减毒方法进行炮制。尽管在汉方医学中附子是重要的生药之一，但在日本药典生药总则的468品目中，未包括附子，亦没有规定鉴定试验及质量评定的方法。
2.1.1 附子及其制剂临床应用研究
附子及其制剂临床应用研究是最多的，如曾对服用含有附子的汉方方剂患者进行调查，认为除了本身的副作用外，季节因素、煎煮器等都会引起生物碱的变化，因此服药指示是非常重要的。中田真司[2]用当归芍药散加附子使长期应用甲氨蝶呤(MTX)治疗类风湿关节炎出现的间质性肺炎、全身倦怠等副作用得以改善。日本学者报道了4例运用薏苡附子败酱散治疗获效的病例，认为该方对阴证偏虚(病程迁延，抵抗力低下的状态)；皮肤干燥(未必是全身性的，仅是局部表现亦可)。另外，对无回盲部周围抵抗、放射性压痛者，该方亦有效[3]。日本研究与应用麻黄附子细辛汤较多，除单方使用之外，还与桂枝汤合方治疗过敏性鼻炎，与桂枝汤去芍药合方而成桂姜枣草黄辛附汤治疗慢性头痛、感冒等症，均获较好疗效[4]。也有学者研究表明临床治疗过程中若疗效不明显时，加用少量附子可提高疗效[5]。
日本学者曾从我国产乌头中分离出次乌头碱、乌头碱和新乌头碱,另一种称为卡乌碱。1974年小管卓夫[6] 等从日本乌头中分离得到一种水溶性的无色板状结晶，稀释至10亿分之一浓度对离体蛙心仍显示强心活性，定名为higenamine(消旋去甲乌药碱)。
2.2 国内研究现状述评
中药附子自古以来为中医常用植物药之一。《神农本草经》中列为下品，收为大热之药，用以治疗“阳衰欲脱身凉肢冷脉微欲绝”，是回阳救逆的药物，也是古代温剂中常用的生药。多年来医药科学工作者对附子的生药、炮制、方剂、化学、药理、毒性和临床等方面进行了广泛的研究，以期减少毒性，增加疗效，寻找有效成分阐明药物作用的机理。
近代医药学的研究认为附子对神经系统、循环系统、泌尿器官、物质代谢等方面都具有作用。目前各个方面还在进行着广泛的研究。
2.2.1 附子主要化学成分
附子毒性物质成分主要为乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等乌头属类生物碱，主要有效成分为消旋去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱等生物碱，而乌头碱、新乌头碱、次乌头碱既是毒性成分又是有效成分[7]。此外，还分离出具有药理活性的氯化甲基多巴胺等。
2.2.2 附子炮制工艺及含量测定研究
附子在6月下旬至8月上旬，采挖后，除去母根、须根及泥沙，习称“泥附子”，再以食用胆巴等经长时间加工成下列规格:“盐附子”、“黑顺片”、“白附片”，甘草，黑豆[8-9]制淡附片，亦有用豆腐制者。2010年版《中国药典》中对附片(黑顺片和白附片)质量的要求：含双酯型生物碱以新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的总量计(不得过0.020％），含生物碱以乌头碱计，不得少于1.0%，含苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱及苯甲酰新乌头原碱的总量不得少于0.010%为质量控制指标。
煎煮时间与方法上选择附子宜热水煎煮40min以上或者直接煎煮50min以上[10]。经实验证明附子皮中生物碱的含量高，毒性大，为了保证其临床有效性与安全性，黑顺片与白附片临床应用应有所区分[11]。黑顺片和白附片之间的相似度较高，盐附子与他们之间的相似度较低[12]。研究表明煎煮能有效减小附子毒性且总生物碱含量基本不变，为临床大剂量使用附子提供依据。
炮制方法研究方面，采用高效液相色谱法分析附子炮制品中4个生物碱的含量，结果是双酯型生物碱的量都得到有效降低，但单酯型生物碱的含量明显增加。说明它与《中国药典》炮制法一样，具有相同的炮制减毒功效。
2.2.3 附子配伍减毒增效
附子与干姜、甘草配伍减毒增效：研究表明附子配伍甘草后合煎液毒性成分低于单煎液，但附子配伍甘草后对附子抗炎和镇痛药效没有明显影响。采用紫外分光光度法测定不同附子炮制品与干姜不同比例配伍前后总生物碱的煎出量各不相同，但配伍干姜后总生物碱煎出量均增加。说明热性的附子配伍热性的干姜后增强了附子回阳救逆等功效，也印证了“附子无姜不热”这一传统的药性理论。
2.2.4 附子应用毒性控制
应用附子时应当注意配伍药物以防范其毒性作用。《本草经集注》：“俗方每用附子，皆须甘草、人参、生姜相配者，正制其毒也。”李可老中医在应用附子时常配伍炙甘草，当与乌头合用时再加防风、黑小豆30g，蜂蜜150g。万一有附子中毒时，李可老中医应用经验方(生大黄、防风、黑小豆、生甘草各30g，蜂蜜150g)煎汤送服生绿豆粉30g，均在40min内救活患者[13]。王均宁[14]等通过统计分析3188首含有附子的方剂，得出通过以寒制热、以甘缓毒、以柔克刚、以守约行、调正制毒等配伍方法可控制附子毒性的结论。
2.2.5 附子相关药理实验
有研究报道表明附子不同炮制品(盐附子、黑顺片、白附片)的镇痛抗炎作用差异，黑顺片具有良好的镇痛抗炎作用，盐附子仅镇痛作用效果明显，白附片镇痛抗炎作用效果均不明显[15]。张丽萍[16]等采用小鼠灌胃急性毒性实验来考察加压蒸制附子的安全性。以小鼠可承受最大体积灌胃给药，进行最大给药量测定。结果为实验结束时无动物死亡，在最大给药量为临床成人最大用量的1280倍时未见急性毒性反应，证明加压炮制附子临床用药较为安全。
附子炮制方法经历代医家不断改进，至今已逾70余种[17]，商品规格多达11个，除了《中国药典》上的白附片、黑顺片、炮附片、淡附片以外，还有黄附片、挂片、熟附片、炮附片等品种。附子主要的传统炮制工艺是经胆巴水浸制、煮、水漂等工艺，这样做可促进剧毒生物碱的水解，使之转化为毒性较低的生物碱，从而降低有毒生物碱的含量。经过上述炮制，附子中的剧毒生物碱成分主要为次乌头碱，毒性相对小于乌头碱和中乌头碱，毒性更大的乌头碱含量则测不到或者极低，从而保证其临床应用的安全性，但是大量有效成分在传统加工过程中流失，成品的总生物碱含量仅为加工前生附子的1/6[18]。因浸泡时间、温度、煎煮时间和温度不同，产地加工的制附子成分含量相差1O倍[19]。
目前附子没有全国统一规范的炮制工艺，任意增加或者减少炮制工序，造成的结果是炮制不足或炮制过度，炮制不足则导致用药容易中毒，炮制过度则难于保证用药有效性。有研究者用高压炮制川乌省时、省力，对药物降毒效果明显[20]。可将其研究思路用于附子，以降毒增效，缩短炮制时间，改进大生产工艺。
3 研究内容
3.1 基源研究
附子，毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品。四川、陕西省为主要栽培产区，中医几千年来传统认定的道地药材为川附子。附子的原植物为毛茛科(Ranunculaceae)植物乌头(Aconitum carmichaeli Debx)的子根。采收季节一般为6月下旬至8月上旬，采挖后，除去母根、须根及泥沙，习称“泥附子”，可用食用胆巴等经长时间加工成:“盐附子”、“黑顺片”、“白附片”[21]，其主根晒干即为生药川乌或乌头。
3.2 产地加工
附子由于毒性强，古今都很重视附子加工炮制，根据查找文献所知关于附子的产地加工不必繁琐，只需要在产地用食用胆巴的水溶液浸泡过夜，再加食盐，继续浸泡，晒晾，并逐渐延长晒晾时间，直至附子表面出现大量结晶盐粒（盐霜）体质变硬[22]。这样加工有利于有效成分的保存，可减少用药量，节约药材，且由于成分含量差异不大，利用医生掌握剂量，省工、省时，降低成本；制出的附子既可当生附子使用，又可按有关要求进一步加工成炮、炒、醋制应用。
3.3 炮制方法研究
传统炮制工艺是在产地进行洗净，泡胆巴，煮，剥皮，切片，漂片，煮片，烤片等处理，在此过程中附子生物碱流失高达81.3%，其中泡胆巴31.6%，漂片33.6%，煮片16.1%[23]。高压蒸制法由于操作简单，可控，省时，且去毒效果好，已成为现代研究的热点。本研究参考川乌高压蒸制炮制工艺[24]，采用L9(33)正交试验对高压蒸制的主要因素进行考虑，多指标综合优选附子的高压蒸制降毒工艺，旨在建立一个省时高效的附子炮制方法。

4 高压蒸制工艺研究
通过不同条件的高压蒸制对附子中三种双酯型生物碱及其水解产物变化规律的研究，结合毒性，揭示炮制对附子减毒存效(增效)的机理，优化炮制工艺，为制定附子饮片减毒增(存)效的多指标综合评价体系提供依据。
通过传统的性状比较和HPLC法测定双酯型生物碱(乌头碱、次乌头碱)的含量来考察它们的质量。
4.1 实验方法
4.1.1 实验材料及仪器
高效液相色谱仪(Alltech uvis 200 Detector)，电子天平(Sartorius Cp225D)乌头原碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱对照品，苯甲酰次乌头原碱对照品（中国药品生物制品检定所,纯度均≥98.0％），乙腈、四氢呋喃为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水，盐附子(附子产地陕西城固，经陕西国际商贸学院医药学院生药炮制教研室雷国莲教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconlium carmiehaeli Debx.的干燥子根盐制品，即盐附子)。
4.1.2 4种酯型生物碱的含量测定色谱条件
Brava BDS-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5µm)，流动相乙腈-四氢呋喃25:15(A)-0.1%ml/min乙酸铵(1L加冰乙酸0.5ml)B),流速0.8ml/min，检测波长235nm，柱温30℃，理论塔板数4种生物碱均不低于3000。
4.1.3 制备对照品溶液
分别精密称取乌头碱2.04mg，次乌头碱1.61mg，苯甲酰乌头原碱3.04mg，苯甲酰次乌头原碱3.19mg，置于10ml容量瓶中，加入0.05%盐酸-甲醇溶液，稀释至刻度，摇匀，得混合对照品a溶液，精密移取该溶液1.0ml置于10ml容量瓶中，用0.05%盐酸-甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得混合对照品b溶液。
4.1.4 供试品溶液制备
分别精密称取附子生品及其炮制品粉末(50目) 1.0000g，2.0000g，置具塞锥形瓶中，精密加入氨试液3ml与异丙醇-乙酸乙酯(1:1)混合溶液50ml，摇匀，称定质量，放置16h，连续超声30min，冷却，称定质量，用混合溶液补足减失质量，摇匀，滤过，精密移取续滤液25ml，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入0.05%的盐酸-甲醇溶液5ml溶解，摇匀，过0.45µm滤膜，取续滤液，即得。
4.1.5 标准曲线的制备
精密吸取混合对照品a溶液2，4，6，8，10，12，16，20µl，混合对照品b溶液1，2，4，6，8，10µl，按照上述色谱条件，测定，以各生物碱对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得标准曲线及回归方程，见表4.1。
表4.1 附子中4种生物碱的回归方程及线性关系
对照品 线性范围/µg 回归方程 R2
次乌头碱 0.02019～0.2019 Y=1127.09X+1.70 0.99998
乌头碱 0.02019～0.2019 Y=991.17X+3.41 0.99992
苯甲酰乌头原碱 0.02989～0.2989 Y=865.01X+2.35 0.99994
苯甲酰次乌头原碱 0.02989～0.2989 Y=1000.42X+2.14 0.99996
4.1.6 精密度实验
精密吸取含4种生物碱的混合对照品b溶液，重复进样5次，每次10µl，并测定4种生物碱的RSD值，结果见表4.2。
表4.2 附子对照品中4种生物碱的RSD值
名称
乌头碱
次乌头碱
苯甲酰乌头原碱
苯甲酰次乌头原碱
RSD值
0.7%
0.7%
0.9%
0.9%
表4.2结果说明，仪器精密度良好。
4.1.7 稳定性实验
精密称取同一批号的附片粉末1.0000g，按上述供试品制备方法制备成供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，分别在0，4，8，16，24h进样10µl，并测定4种生物碱的峰面积RSD值，结果见表4.3。
表4.3 附子中4种生物碱的RSD值
名称
乌头碱
次乌头碱
苯甲酰乌头原碱
苯甲酰次乌头原碱
RSD值
1.6%
2.6%
0.9%
2.0%
表4.3结果说明，供试品溶液在24h内稳定。
4.1.8 重复性实验
精密称取同一批号的附片3份，依上述供试品溶液制备方法制备和上述条件测定4种生物碱的RSD值，结果见表4.4。
表4.4 附子中4种生物碱的RSD值
名称
乌头碱
次乌头碱
苯甲酰乌头原碱
苯甲酰次乌头原碱
RSD值
1.6%
3.3%
2.1%
2.4%
表4.4结果说明，本方法重复性良好。
4.1.9 加样回收试验
精密称取生附片饮片粉末3份，每份约0.5000g，分别置于具塞锥形瓶中，各精密加入乌头碱、次乌头碱等4种对照品适量，按供试品制备方法制备成供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定4种生物碱的平均回收率，结果见表4.5。
表4.5 附子中4种生物碱的平均回收率与RSD值
名称
乌头碱
次乌头碱
苯甲酰乌头原碱
苯甲酰次乌头原碱
回收率
99.9%
97.9%
98.4%
101.2%
RSD值
2.9%
2.8%
2.7%
2.5%
表4.5结果说明，该方法测定结果准确可靠。
4.1.10 样品测定
上述含量测定方法，测定附子生品及其炮制品中乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量见表4.6。
表4.6 附子样品中4种生物碱含量比较（mg.g-1）
名称
乌头碱
次乌头碱
苯甲酰乌头原碱
苯甲酰次乌头原碱
含量
0.0352
0.4573
0.0462
0.1076
4.2 总生物碱的含量测定
按2010年版《中国药典》一部附子项下总生物碱含量测定方法即滴定法进行测定，选择甲基红指示剂指示滴定终点。
4.3 高压蒸制工艺的优选[25-28］
据相关炮制资料的研究，确定附子的水处理所用胆巴使用量与药材的比例为1∶2，对附子软化方式可以用润湿法(即取大小均匀的生附子，除去杂质，置于密闭容器中，喷洒适量的胆巴溶液，使药材全部湿润，润0.5小时并搅拌)，润透法(即取大小均匀的生附子，除去杂质，置于密闭容器中，喷洒适量的胆巴溶液，使药材全部湿润，底部不积水为度，上盖胆巴溶液浸湿的脱脂棉，每隔1h拌润1次，至个大药材切开内无干心)，不换水浸泡法(即取大小均匀的附子，除去杂质，置于密闭容器中，加入胆巴溶液使其盖过药面1～2cm，不换水浸泡至个大药材切开内无干心)；在预试验基础上，选择高压蒸制时间、压力和水处理方式为考察因素，建立3因素3水平的正交试验因素水平表，见表4.7，以传统外观性状、工艺生产难易程度和生物碱含量为评价指标，以此来对附子的高压蒸制工艺进行优选。
水平
A高压蒸制时间/min
B压力/MPa
C水处理方式
1
90
0.07
润透法
2
150
0.10
润湿法
3
180
O.15
不换水浸泡法
表4.7 附子高压蒸制工艺优选正交试验因素水平
双酯型生物碱毒性最强，在炮制的过程中转化为低毒单酯型生物碱和其他生物碱，给予权重50%，总生物碱含量给予权重35%，外观质量权重15%，综合评分=双酯型生物碱总含量评分×50%+总生物碱含量评分×35%+炮制品外观评分×15%，满分为1.000。取大小均匀的生附子样品9份，每份500g，用相应的水处理方式进行炮制，取出，晾干。在相同温度（室温）下进行传统外观质量评分，见表4.8，并测定其生物碱的含量试验安排及结果，见表4.9及方差分析，见表4.10。
表4.8 附子高压蒸制品外观评分标准
项目
10分
7分
5分
1分
色泽
乌黑发亮
黑褐色
皮部黄褐色
木部黄白色
黄白色
质地
质地实酥脆
断面光泽
质地实较为酥脆；断面较有光泽
质较坚实略呈粉性；断面略有光泽
质硬呈粉性；断面粗糙
气味
气微无麻舌感
气微微有麻舌感
气微有麻舌感
气微麻舌感强烈

表4.9 附子高压蒸制工艺优选正交试验安排
NO.
A
B
C
D
质量分数/mg.g－1
外观评分/分
综合评分
双酯型生物碱
总生物碱质量
1
1
1
1
1
0.101
9.0
4
0.418
2
1
2
2
2
0.031
8.6
8
0.782
3
1
3
3
3
0.071
7.8
9
0.584
4
2
1
2
3
0.050
8.3
8
0.686
5
2
2
3
1
－
8.1
9
0.919
6
2
3
1
2
0.027
7.8
9
0.785
7
3
1
3
2
0.052
7.4
8
0.644
8
3
2
1
3
－
8.5
9
0.933
9
3
3
2
1
0.035
7.9
9
0.755
K1
1.784
1.748
2.136
2.092

K=K1+K2+K3=6.506

K2
2390
2.634
2.223
2.211
K3
2.332
2.124
2.147
2.203
R
0.606
0.886
0.087
0.119
注: － 代表未检出，计算时按0.000计
由表4.9结果可知，A因素极差为0.606，B因素极差为0.886，C因素极差为0.087，则影响附子高压炮制的因素的主次顺序为B(压力)>A(高压蒸制时间)>C(水处理方式),B因素对本品的提取影响最大，A因素对本品的提取影响较大，C因素对本品的提取影响最小。从K值分析，A因素K2>K3>K1，应选A2；B因素K2>K3>K1，应选B2；C因素K2>K3>K1应选C2，同时由表4.10 综合评分方差分析可知，因素A，B具有显著性影响(P<0.05)，确定附子高压炮制的最佳工艺为A2B2C2，即附子经润湿法处理后，于0.10MPa压力下炮制150min。
4.4 验证试验及炮制前后生物碱含量比较
为了进一步验证上述工艺与试验结果是否一致，现按照该工艺进行放大实验。随机选取大小均匀的附子3份，每份500g，按优选的高压蒸制工艺将附子经润湿法处理后，于0.10MPa压力下炮制150min，测定其4种生物碱和总生物碱的含量(mg.g-1)，结果见表4.11。
表4.10 综合评分方差分析
方法来源
SS
F
MS
f
p
A
0.074
2
0.037
25.297
＜0.05
B
0.132
2
0.066
44.988
＜0.05
C
0.002
2
0.001
0.518
－
D(误差)
0.003
2
0.002
－
－
注: F0.05(2,9)=4.26 F0.1(2,9)=8.02
表4.11 附子炮制前后生物碱含量比较（mg.g-1）
名称
苯甲酰乌头原碱
苯甲酰次乌头原碱
总单酯型生物碱

次乌头碱

乌头碱
总双酯型生物碱
总生物碱
生附子

0.0463

0.1075

0.1538

0.4573

0.0352

0.4925

9.7415
蒸附子

0.1978

0.1820

0.3798

0.0584

-

0.0584

7.2107
由表4.11可知，附子生品主要含有双酯型生物碱和单酯型生物碱，经高压蒸制法处理后其双酯型生物碱大大降低，单酯型生物碱明显增加，总生物碱含量变化不大，说明该优选工艺稳定可行，适合工业化生产。

5 结论
5.1 生物碱含量变化规律
本实验制得的附片均能测到4种生物碱，但其含量在一定范围内随炮制压力的升高而变化，相关性表现为双酯型生物碱和总生物碱负相关，单酯型生物碱正相关，炮制时间对附子炮制有直接影响。研究发现，同一炮制条件下高压制附子时，双酯型生物碱的总量随蒸制时间延长而降低，平衡好压力和炮制时间是关键。在实验中还对含水量进行测定，研究文献发现，酯型生物碱在水存在条件下，其水解比较完全[29］，而3种软化方式处理后，保留了一定水分，有利于水解作用。
5.2黑顺片验证实验工艺
2010年版《中国药典》收载了3种炮制规格的附子(黑顺片、白附片和炮附片)及1种利于附子储藏的保存方式-盐附子，3种规格附子的功效均以温肾壮阳、填补命门之火为主，但在临床上各有侧重，黑顺片与白附片以回阳救逆散寒止痛，炮附子以温肾暖脾为主[30］。本实验将黑顺片蒸煮的炮制方式更改为高压蒸制方式，得到的附子加工品与2010年版《中国药典》规定的黑顺片相比，在外观上有极大的相似度，且在含量上也符合规定，可考虑作为黑顺片的替代炮制方式［31］。
5.3 附子高压蒸制工艺的可行性
含量测定结果显示，总双酯型生物碱和总单酯型生物碱的含量均落在2010年版《中国药典》的限量范围内。与传统蒸煮工艺相比，高压蒸制法在一定程度上节约时间和资源，且需要的设备较简单，从本质上实现了附子饮片的参数化炮制，具有生产指导意义。
5.4 附子高压蒸制工艺的发展前景
附子中的生物碱具有强心镇痛作用，经炮制后，单酯型生物碱含量的提高与双酯型生物碱的降低是否能促进附子回阳救逆的功效［32］。附子高温炮制是附子发挥药效的关键，高温炮制后作用机制等的研究还有待进一步探索，由于该炮制工艺改进较大，为保证其安全性和有效性，需进行毒理学和药理学研究。
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致 谢
在论文完成之际，我要特别感谢我的指导老师崔老师的热情关怀和悉心指导。在我撰写论文的过程中，崔老师倾注了大量的心血和汗水，无论是在论文的选题、构思和资料的收集方面，还是在论文的研究方法、实验以及成文定稿方面，我都得到了崔老师悉心细致的教诲和无私的帮助，特别是她广博的学识、深厚的学术素养、严谨的治学精神和一丝不苟的工作作风使我终生受益，在此我表示真诚地感谢和深深的谢意。
在论文的写作过程中，也得到了许多同学的宝贵建议，同时还到许多在工作过程中许多同事的支持和帮助，在此一并致以诚挚的谢意，感谢所有关心、支持、帮助过我的良师益友。
最后，向在百忙中抽出时间对本文进行评审并提出宝贵意见的各位老师表示衷心地感谢！
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