大肠埃希菌外膜囊泡对乳腺癌细胞增殖及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响.pdf

Vol.43 No.10 Oct.2023上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（10）大肠埃希菌外膜囊泡对乳腺癌细胞增殖及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响王斓茜1，2，马官荣1，2，姜咏竹1，2，常秀林1，2，方廖琼1，白晋1，21.重庆医科大学生物医学工程学院，超声医学工程国家重点实验室，重庆 400016；2.重庆医科大学重庆市生物医学工程学重点实验室，重庆 400016摘要 目的分析大肠埃希菌外膜囊泡（Escherichia coli outer membrane vesicle，E.coli-OMV）在体外对小鼠4T1乳腺癌细胞增殖的影响，在体内对BALB/c-4T1荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。方法从E.coli的培养上清液中收集OMV并进行表征。采用荧光标记追踪法检测E.coli-OMV被4T1细胞摄入的情况。采用CCK-8法测定E.coli-OMV对4T1细胞增殖的影响。采用流式细胞术检测E.coli-OMV对4T1细胞周期的影响。利用皮下接种法建立BALB/c-4T1荷瘤小鼠模型，而后将小鼠分为E.coli-OMV组与对照（Control）组（每组10只）；前者于每2 d注射0.25 mg/kg E.coli-OMV，后者则注射等剂量的PBS。观察2组小鼠的体质量、40 d生存率、肿瘤体积及质量变化，采用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H-E染色）评价肿瘤组织的病理学形态，采用免疫组织化学染色法观察肿瘤组织中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）与细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达情况。结果E.coli-OMV是粒径为（216.0018.30）nm的球形膜囊结构，可表达E.coli外膜蛋白A（outer membrane protein A，OmpA）与OmpC。荧光显微镜的观察结果显示4T1细胞可摄入E.coli-OMV。CCK-8法的结果显示，E.coli-OMV对4T1细胞的抑制作用与时间-剂量呈正相关。流式细胞术的结果显示，E.coli-OMV将4T1细胞的生长周期阻滞于G0/G1期。体内实验显示，与Control组相比，E.coli-OMV组小鼠的体质量在初期注射后稍有下降（P=0.031），而后出现回升；其40 d生存率增加（P=0.037）；该组小鼠肿瘤的体积、质量的增长量均较少（P=0.041，P=0.004），其肿瘤体积抑制率达29.69%、肿瘤质量抑制率达49.81%。H-E染色的结果显示，E.coli-OMV组小鼠肿瘤组织细胞核分裂象较Control组减少（P=0.038）。免疫组织化学染色的结果显示，E.coli-OMV组小鼠肿瘤组织中的PCNA及CyclinD1阳性表达较Control组减少（P=0.031，P=0.002）。结论体外研究与体内研究均表明，E.coli-OMV可对4T1细胞的增殖产生明显的抑制作用。关键词细菌外膜囊泡；乳腺癌；细胞周期；抑瘤作用DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.10.004 中图分类号R737.9 文献标志码AEffects of Escherichia coli outer membrane vesicles on proliferation of breast cancer cells and tumor growth of tumor-bearing miceWANG Lanxi1,2,MA Guanrong1,2,JIANG Yongzhu1,2,CHANG Xiulin1,2,FANG Liaoqiong1,BAI Jin1,21.State Key Laboratory of Ultrasound in Medicine and Engineering,College of Biomedical Engineering,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Chongqing Key Laboratory of Biomedical Engineering,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,ChinaAbstract Objective To analyze the effect of Escherichia coli outer membrane vesicle(E.coli-OMV)on the proliferation of 4T1 breast cancer cells in vitro and the inhibition of tumor growth in BALB/c-4T1 tumor-bearing mice in vivo.Methods OMVs were collected from the culture supernatant of E.coli and characterized.The uptake of E.coli-OMV by 4T1 cells was detected by fluorescent label tracking method.The effect of E.coli-OMV on 4T1 cell proliferation was detected by CCK-8 method.The effect of E.coli-OMV on 4T1 cell cycle was detected by flow cytometry.The BALB/c-4T1 tumor-bearing mouse models were established by subcutaneous inoculation,and the mice were divided into E.coli-OMV group and Control group,with 10 mice in each group.The mice in the E.coli-OMV group were injected with 0.25 mg/kg E.coli-OMV every 2 d,while the mice in the Control group were injected with equal doses of PBS.The changes in body weight,40 d survival rate,tumor volume and tumor weight of the two groups 论著 基础研究作者简介 王斓茜（1998），女，硕士生；电子信箱：。通信作者 白 晋，电子信箱：。Corresponding Author BAI Jin,E-mail:.网络首发 https:/ 17:43:52)。12452023,43（10）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.10 Oct.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)of tumor-bearing mice were observed.The pathological morphology of the tumor tissues was evaluated by hematoxylin-eosin staining(H-E staining).The expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and CyclinD1 in tumor tissues was observed by immunohistochemical staining.Results E.coli-OMV was spherical membrane vesicle structure with a particle size of(216.0018.30)nm,which expressed E.coli outer membrane protein A(OmpA)and OmpC.Fluorescence microscopy results showed that 4T1 cells could intake E.coli-OMV.CCK-8 results showed that the inhibitory effect of E.coli-OMV on 4T1 cells was positively correlated with time-dose.Flow cytometry results showed that E.coli-OMV arrested the growth cycle of 4T1 cells in G0/G1 phase.In vivo experiments showed that compared with the Control group,body weight of mice in the E.coli-OMV group decreased slightly after the initial injection(P=0.031),and then recovered,while 40 d survival rate increased(P=0.037).The growth of tumor volume and weight of mice in E.coli-OMV group were lower than those in the Control group(P=0.041,P=0.004).Its tumor volume inhibition rate reached 29.69%,and tumor weight inhibition rate reached 49.81%.The results of H-E staining showed that nuclear splitting images of tumor tissues of mice in the E.coli-OMV group decreased compared to the Control group(P=0.038).The results of immunohistochemical staining showed that the positive expression of PCNA and CyclinD1 in the tumor tissues of mice in the E.coli-OMV group decreased compared to the Control group(P=0.031,P=0.002).Conclusion Both in vitro and in vivo studies show that E.coli-OMV can significantly inhibit the proliferation of 4T1 cells.Key words bacterial outer membrane vesicle;breast cancer;cell cycle;tumor-suppressing effect乳腺癌是女性易发且较为常见的恶性肿瘤，是全世界女性癌症死亡的第二大原因1-2。传统的乳腺癌治疗方法包括手术治疗、放射治疗、化学治疗等，但其效果均不够显著，使得新的癌症治疗策略有待继续开发。相关研究表明，微生物疗法或将能够为目前常规癌症疗法无法满足的临床需求提供全新的解决方案，如 细 菌 介 导 的 癌 症 疗 法（bacteria-mediated cancer treatment，BMCT）已应用于临床诸多恶性肿瘤的治疗3。研究4-5显示，多种细菌如大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）具有天然的肿瘤细胞杀伤能力，可诱导肿瘤细胞发生凋亡或使细胞增殖受到抑制，还可进入肿瘤区域通过细胞增殖来减少氧气和营养供应以形成坏死区域，使瘤区中心的肿瘤细胞死于饥饿和窒息，从而表现出良好的抗肿瘤效果。然而，细菌在肿瘤区域定植后发生的不可控制的大量繁殖会引发机体脓毒血症、感染性休克等较多不良反应，因 此 BMCT 在 临 床 上 的 应 用 仍 存 在 巨 大挑战6-7。细 菌 外 膜 囊 泡（bacterial outer membrane vesicle，OMV）是由细菌释放的纳米颗粒8。相较于细菌，OMV 不可自主复制且具有更高的剂量可控性与生物安全性9-10，同时其主要携带有亲本细菌的外膜蛋白、周质等成分，在功能上与亲本细菌具有相似性11-13。基于此，本研究拟提取大肠 埃 希 菌 外 膜 囊 泡（Escherichia coli outer membrane vesicle，E.coli-OMV），并探讨其对小鼠4T1 乳腺癌细胞增殖、乳腺癌荷瘤小鼠模型肿瘤生长的抑制作用，以期为基于 OMV 的临床肿瘤治疗提供新思路。1对象与方法1.1细胞来源及培养小鼠4T1乳腺癌细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。使用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培养基，在37、5%CO2的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行后续实验。1.2菌株来源与培养大肠埃希菌 BL21（DE3）菌株购自上海唯地生物技术有限公司。将冻存于80 的 BL21（DE3）菌株接种于LB培养基，于37 摇床培养20 h后用于后续实验。1.3实验动物使用健康 BALB/c雌性小鼠 20只，月龄 68周，体质量2025 g购自湖南斯莱克景达实验动物有限公 司，动 物 生 产 许 可 证 号 为 SCXK（湘）2019-0004。所有实验动物均饲养于相同的标准实验环境中，即温度为（235）、湿度为（455）%、明暗周期为12 h、自由摄食及饮水，动物使用许可证号为SYXK（渝）2018-0003。1.4主要试剂与仪器CCK-8 试剂盒（Dojindo，日本），胎牛血清、RPMI 1640培养基（Gibco，美国），增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）兔单克隆抗体、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）兔单克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司），E.coli外膜蛋白A1246王斓茜，等大肠埃希菌外膜囊泡对乳腺癌细胞增殖及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（10）（outer membrane protein A，OmpA）多克隆抗体（上海起发实验试剂有限公司），E.coli O157：H7 OmpC多克隆抗体（Thermo Fisher，美国），即用型免疫组化ElivisionTM Super检测试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），增强型DAB显色试剂盒（20）（北京索莱宝科技有限公司）。Amicon Ultra-15 100kDa超滤离心管（Millipore，美国），Optima XPN-100 超高速离心机、CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter，美国），INFINITE M PLEX荧光多模式酶标仪（Tecan，瑞士），透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）（Hitachi，日本）。1.5E.coli-OMV的提取与鉴定1.5.1E.coli-OMV 的提取采用超滤离心法制备E.coli-OMV14。在 4、5 000g 下离心含有 BL21（DE3）菌株的 LB 培养液，获得上清液后依次使用0.45 m、0.22 m滤膜进行过滤，并使用超滤离心管对滤液进行浓缩。而后，在4、150 000g下超速离 心 上 述 浓 缩 液，使 用 磷 酸 盐 缓 冲 液（sodium phosphate buffer，PBS）重悬沉淀物后于80 保存备用。1.5.2E.coli-OMV的鉴定使用PBS稀释新鲜制备的E.coli-OMV后，采用纳米粒度仪对其粒径进行检测。采用 3%半凝固琼脂糖包埋新鲜制备的 E.coli-OMV沉淀后进行切片，再通过TEM观察E.coli-OMV的形态。采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测E.coli-OMV的OmpA、OmpC的表达，即取5 g蛋白样品行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，经转膜封闭后依次孵育OmpA、OmpC一抗和相应二抗（工作浓度均为 15 000），最后使用ECL化学发光成像试剂进行显影。1.64T1细胞摄入E.coli-OMV的检测使用 PKH67外泌体绿色荧光标记染料对 E.coli-OMV进行染色，具体染色步骤参照其说明书。采用PBS 重 悬 已 标 记 好 的 E.coli-OMV，避 光 储 存 在80。将4T1细胞以2104个/孔接种于6孔板中，培养12 h后向每孔加入2 mL含有标记完成的E.coli-OMV的RPMI 1640完全培养基，共培养0、6、12 h。采用DAPI 对细胞核进行染色，而后用荧光显微镜观察4T1细胞对E.coli-OMV的摄入情况。1.74T1细胞增殖的检测采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对“1.5.1”部分得到的E.coli-OMV进行外膜总蛋白浓度检测，具体操作参见该试剂盒说明书。将4T1细胞以6103个/孔接种于96孔板中，培养12 h 后用含有不同浓度 E.coli-OMV 的 RPMI 1640 完全培养基E.coli-OMV终浓度为0（Ctrl组）、1、10、20、50 g/mL分别培养12、24、48 h。经PBS洗涤后，向每孔加入 100 L 含有 10%CCK-8 试剂的RPMI 1640完全培养基，共孵育1 h后使用多功能酶标仪检测细胞的 D（450 nm）。细胞抑制率（%）=（1-DE.coli-OMV/DCtrl）100%。1.84T1细胞周期的检测将4T1细胞以2106个/孔接种于6孔板中，使用无血清RPMI 1640培养基培养12 h，对细胞进行饥饿处理。用含有不同浓度 E.coli-OMV的 RPMI 1640完全培养基 E.coli-OMV 终浓度均为 0（Ctrl 组）、5、10、20 g/mL 分别培养 12、24、48 h 后，收集细胞并向其中加入 70%冰乙醇，于 4 过夜行细胞固定。次日，使用含0.1%Triton X-100的PI进行细胞膜透化并行DNA染色，而后通过流式细胞仪对细胞周期进行检测。1.9BALB/c-4T1荷瘤小鼠模型建立及分组将100 L密度为5105个/mL的4T1细胞悬液注射于小鼠背部皮下，10 d后待肿瘤体积达100 mm3则提示BALB/c-4T1荷瘤小鼠模型建立成功。将该模型小鼠随机分为 E.coli-OMV 组和对照（Control）组，每组10只。其中，每2 d向E.coli-OMV组小鼠的肿瘤区域注射E.coli-OMV溶液（浓度为50 g/mL，单次剂量为5 mL/kg），共5次；同时，Control组小鼠注射等体积的PBS。分别用于后续体质量及生存率测定实验（每组5只），以及肿瘤组织的体积、质量、抑制率测定实验（每组5只）。1.10E.coli-OMV抑瘤效果评估1.10.1小鼠体质量及生存率测定从初次注射开始，每 2 d 分别对 2 组小鼠进行称重，该部分数据统计时间结点为第 20 日。末次注射后，每日记录12472023,43（10）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.10 Oct.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)各组小鼠发生死亡的数量；数据统计时间结点为第45 日，对第 45 日后依然存活的小鼠按生存 45 d计算。1.10.2肿瘤组织的体积及其抑制率测定使用游标卡尺分别对 2 组小鼠肿瘤组织的长径（L）和短径（W）进行测量，计算肿瘤组织的体积（V）及其抑制率。公式为：V（mm3）=LWW0.5，肿瘤组织体积抑制率（%）=（VControlVE.coli-OMV）/VControl100%。1.10.3肿瘤组织的质量及其抑制率测定于注射结束后10 d处死小鼠，分别测量2组小鼠肿瘤组织的质量（M）并计算肿瘤组织质量抑制率。公式为：肿瘤质量抑制率（%）=（1ME.coli-OMV/MControl）100%。1.10.4肿瘤组织的病理学变化分析采用4%多聚甲醛对2组小鼠的肿瘤组织固定后，常规石蜡包埋并制成切片。行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H-E染色），并通过光学显微镜观察肿瘤组织结构及细胞核分裂象。1.10.5肿瘤组织增殖标志物及周期蛋白表达的检测采用免疫组织化学染色法对“1.10.4”部分得到的石蜡切片进行染色，其中一抗为PCNA、CyclinD1（工作浓度均为1100），二抗使用即用型免疫组化 ElivisionTM Super 试 剂 盒 孵 育，最 后 使 用 增 强 型 DAB 显色试剂盒显色，具体步骤操作均依据相关说明书。通过光学显微镜观察组织阳性染色情况，并采用 Image J 软件计算阳性细胞染色的平均光密度。1.11统计学方法采用 GraphPad Prism 8.0 统计学软件进行分析。定量资料以 xs表示，2组间比较采用独立样本 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1E.coli-OMV的表征分析本研究对 E.coli-OMV 的一般特征进行鉴定。TEM的观察结果（图1A）显示，E.coli-OMV呈纳米级别的球形结构，具有脂质双层膜。纳米粒度仪的分析结果（图 1B）显示，E.coli-OMV 的平均粒径为（216.0018.30）nm。Western blotting的结果（图1C）显示，E.coli-OMV 在 35 000 和 38 000 处分别存在E.coli的外膜标志性蛋白，即OmpC和OmpA，继而证明其为E.coli外膜来源。2.24T1细胞对E.coli-OMV的摄入观察将荧光标记的E.coli-OMV与4T1细胞作用0、6、12 h后，结果（图2）显示，6 h时4T1细胞质中、细胞核附近出现了绿色荧光标记，12 h时荧光强度增加；继而提示，4T1细胞可摄入E.coli-OMV。2.3E.coli-OMV对4T1细胞增殖的影响CCK-8实验的结果（图3）显示，E.coli-OMV在1 g/mL浓度下对4T1细胞增殖的影响较小；在10、20、50 g/mL浓度下，对 4T1细胞作用 12 h的细胞抑 制 率 分 别 为（2.760.98）%、（15.202.53）%、100 nmABC245 000180 000135 000100 00075 00063 00048 00035 000MarkerE.coli-OMVOmpCOmpA0.51.01.52.02.50Concentration/(particles.mL-1)1 000900800700Size/nm600500400300200100151293387547-Note：A.Transmission electron micrograph of E.coli-OMV.B.Particle size distribution of E.coli-OMV.C.Detection of outer membrane marker proteins in E.coli-OMV by Western blotting.图1E.coli-OMV的一般特征分析Fig 1Analysis of the characterization of E.coli-OMV1248王斓茜，等大肠埃希菌外膜囊泡对乳腺癌细胞增殖及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（10）（22.331.15）%；作用 24 h 的细胞抑制率分别为（26.894.56）%、（32.515.25）%、（44.632.21）%；作用 48 h 的细胞抑制率分别为（33.003.64）%、（43.481.85）%、（54.191.03）%。继而提示，E.coli-OMV可抑制4T1细胞的增殖，且抑制效果呈时间-剂量依赖性。2.4E.coli-OMV对4T1细胞周期的影响采用流式细胞术检测 E.coli-OMV 对 4T1细胞周期的影响，结果（图4）显示与Ctrl组相比，经不同浓度的E.coli-OMV处理的细胞在不同作用时间下处于G0/G1期的占比有所增加，S 期占比减少；其中，E.coli-OMV浓度为10 g/mL时对细胞周期的阻滞现象100 m100 m100 m100 m100 m100 m100 m100 m100 m0 h6 h12 hDAPIPKH67-E.coli-OMVMergeNote：Green fluorescence indicates PKH67-labelled E.coli-OMV,and white arrows indicate E.coli-OMV in the nucleus.图24T1细胞对E.coli-OMV的摄入观察（100）Fig 2Observation on the uptake of E.coli-OMV by 4T1 cells(100)01.00.80.60.40.2Ctrl1 g/mL 10 g/mL 20 g/mL 50 g/mL A1Cell inhibition rate/%12 h24 h48 hBD(450 nm)124824t/h6040200Concentration/(g.mL-1)50201015020101502010Note：A.Effect of the different concentrations of E.coli-OMV on D(450 nm)of 4T1 cells at different time points.B.Analysis of the inhibition rate of E.coli-OMV at different concentrations on 4T1 cell proliferation under different time points.图3CCK-8法检测E.coli-OMV对4T1细胞增殖的影响Fig 3Effect of E.coli-OMV on 4T1 cells proliferation by CCK-8 method12492023,43（10）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.10 Oct.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)最为明显；随着作用时间的增加，各个浓度 E.coli-OMV抑制细胞周期G0/G1期程度也有增加。继而提示，一定剂量的E.coli-OMV可以将4T1细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期，且阻滞效果呈明显的作用时间依赖性。Ctrl group5 g/mL10 g/mL20 g/mL12 h24 h48 hDip G0/G1Dip G2/MDip SE.coli-OMV group0 g/mLA-60050040030020010002040Number60FL2-A PE-A80100-40030020010002040NumberNumber60FL2-A PE-A80100-5004003002001000204060FL2-A PE-A80100-50040030020010002040Number60FL2-A PE-A80100-60050040030020010002040Number60FL2-A PE-A80100-60050040030020010002040Number60FL2-A PE-A80100-80060040020002040Number60FL2-A PE-A80100-50040030020010002040Number60FL2-A PE-A80100-50040030020010002040Number60FL2-A PE-A80100-70060050040030020010002040Number60FL2-A PE-A80100-60050040030020010002040Number60FL2-A PE-A80100-60050040030020010002040Number60FL2-A PE-A80100G0/G1G2/MSG0/G1SG2/MG0/G1SG2/MPercentage of time phases/%Ctrl5 g/mL10 g/mL20 g/mLP=0.000P=0.014P=0.000P=0.000P=0.003P=0.000P=0.004P=0.001P=0.000P=0.000P=0.000P=0.000P=0.000P=0.01P=0.01P=0.00012 h24 h48 hB020406080Note：A.Flow assay graphs of 4T1 cell cycle.B.Effect of different concentrations of E.coli-OMV on 4T1 cell cycle distribution at different time points.图4流式细胞术检测E.coli-OMV对4T1细胞周期分布的影响Fig 4Effect of E.coli-OMV on 4T1 cell cycle distribution by flow cytometry1250王斓茜，等大肠埃希菌外膜囊泡对乳腺癌细胞增殖及荷瘤小鼠肿瘤生长的影响http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（10）2.5E.coli-OMV 对 BALB/c-4T1 荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用2.5.1BALB/c-4T1 荷瘤小鼠的一般情况观察与Control组比较，E.coli-OMV组小鼠在首次注射后的第14日精神状态欠佳，坚毛，活跃程度与注射前比较稍有下降；在第3次注射时精神状况好转。5次注射过程中，2组小鼠均未出现运动失调、活动受限、呼吸困难、烦躁等反应。2.5.2E.coli-OMV对BALB/c-4T1荷瘤小鼠体质量的影响注射前，2组小鼠的平均体质量间差异无统计学意义。首次注射后4 d，E.coli-OMV组小鼠的平均体质量较 Control组稍有下降（P=0.031），而后逐渐回升至与 Control组持平，最终 2组小鼠的平均体质量间差异无统计学意义（图5）。继而提示，初期注射 0.25 mg/kg 剂量的 E.coli-OMV 可使小鼠体质量有下降，而后则不会对小鼠体质量产生影响。2.5.3E.coli-OMV 对 BALB/c-4T1 荷瘤小鼠生存率的 影 响 对 2 组 小 鼠 的 生 存 率 进 行 观 察，结 果（图6）显示，注射后第26、32、40 d，Control组小鼠生存率分别为80%（4/5）、20%（1/5）、0（0/5），E.coli-OMV 组小鼠生存率分别为 100%（5/5）、60%（3/5）、60%（3/5）；40 d 后，Control组小鼠全部死亡，E.coli-OMV组小鼠仍有存活，组间差异具有统计学意义（P=0.037）。继而提示，0.25 mg/kg 剂量下的 E.coli-OMV 可以延缓由乳腺癌导致的小鼠死亡。2.5.4E.coli-OMV 对小鼠肿瘤体积的影响注射前，2 组小鼠肿瘤体积间差异无统计学意义。注射后，2组小鼠的肿瘤生长曲线如图7A所示；在注射后 20 d，E.coli-OMV 组小鼠肿瘤体积增长量小于Control 组（P=0.041，图 7B），肿瘤体积抑制率达29.69%。2.5.5E.coli-OMV 对小鼠肿瘤质量的影响对 2 组小鼠的肿瘤组织进行解剖观察，结果（图8）显示注射后 20 d，E.coli-OMV 组小鼠的肿瘤组织均小于Control组，肿瘤质量亦小于Control组且差异具有统计学意义（P=0.004），抑瘤率达到 49.81%。继而提示，0.25 mg/kg剂量下的E.coli-OMV可对小鼠4T1肿瘤生长有一定的抑制作用。2.5.6E.coli-OMV对小鼠肿瘤组织病理学变化的影响H-E 染色的结果（图 9）显示，相较于 Control组，E.coli-OMV组小鼠肿瘤组织细胞排列松散、紊乱，病理性细胞核分裂象减少（P=0.038），核仁染色较浅、不明显。02468101214161820Control groupE.coli-OMV groupP=0.031Body weight/g0510152025t/d图52组BALB/c-4T1荷瘤小鼠的体质量变化Fig 5Changes in body weight of BALB/c-4T1 tumor-bearing mice in the two groups01020304050100755025Control groupE.coli-OMV groupSurvival rate/%t/d图62组BALB/c-4T1荷瘤小鼠的生存率分析Fig 6Survival rate analysis of BALB/c-4T1 tumor-bearing mice in the two groups12512023,43（10）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.10 Oct.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)2.5.7 E.coli-OMV 对 小 鼠 肿 瘤 组 织 PCNA、CyclinD1蛋白表达的影响免疫组织化学染色的结果（图 10）显示，2 组小鼠的肿瘤组织均有 PCNA 和CyclinD1阳性表达，且均定位于细胞核，呈棕黄色；与Control组染色阳性区域相比，E.coli-OMV组小鼠肿瘤组织中 PCNA和 CyclinD1阳性表达均减少（P=0.031，P=0.002）。Control groupE.coli-OMV groupA1 5001 0005000BTumor volumn/mm3t/dTumor volumn growth/mm3Control groupE.coli-OMV groupP=0.04124681012141618205001 0001 5002 0000Note：A.Tumor volume growth curve of the mice injected from 0 d to 20 d.B.Tumor volume growth in mice at d 20 post-injection.图72组BALB/c-4T1荷瘤小鼠的肿瘤体积变化Fig 7Changes in tumor volume growth of BALB/c-4T1 tumor-bearing mice in the two groupsControl groupE.coli-OMV groupA1.00.501.5Tumor weight/gP=0.004BControl groupE.coli-OMV groupNote：A.Anatomy picture of tumor tissues in the two groups at 20 d post-injection.B.Statistical analysis of tumor weight in the t