外源性骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内存活状态观察.doc

外源性骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内存活
状态观察

【摘要】 目的 观察外源性骨髓间充质干细胞在活体兔椎间盘微

环境中存活状态。方法 选取健康新西兰大白兔 24 只，体外培养经基

因转染红色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞，待细胞活性状态最

佳时，利用显微注射方法将其注入兔腰椎间盘，分别于术后 1、7、14、

30、60 d 手术取出椎间盘，制备病理学切片，在荧光显微镜下观察外

源性骨髓间充质干细胞是否散发出红色的荧光及荧光细胞数量。结果

术后 1、7、14、30、60 d 椎间盘切片在荧光显微镜下均可观察到荧光，

术后 14 d 细胞所散发出的荧光较术后 1 d 及 7 d 有所减弱，术后 60 d

红色荧光无明显变化。术后 30、60 d 荧光细胞数量较 1～14 d 有所增

加(F=15.171,P<0.01)。结论 手术后 60 d 外源性骨髓间充质干细

胞在活体兔椎间盘内仍处于存活状态。

【关键词】 间质干细胞;椎间盘;逆行变性

[ABSTRACT] Objective To observe the survival condition of

exogenous mesenchymal stem cells (MSC) in microenvironment of

intervertebral disc (IVD) of rabbit. Methods Twenty four

healthy New Zealand white rabbits were selected, and the cells

were micro injected into rabbit IVD when the MSCs were at the

best active state. The IVD was removed on day 1, 7, 14, 30 and

60 after operation, and a pathological section done. To make sure

if red fluorescence was erupted by MSC and the number of

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fluorescyte, an observation was done with fluorescence

microscope. Results The red fluorescence could be seen on all

IVD sections the fluorescence on 14th day after injection was

weaker than that on 1st and 7th day, and obvious red fluorescence

seen on 60th day, the cells were more diffused distribution. The

number of fluorescytes was more on 30th and 60th day than that

on day1-14 (F=15.171,P<0.01) Conclusion Exogenous MSCs can

still survive in living rabbit IVD 60 days after surgery.

[KEY WORDS] Mesenchymal stem cells; Intervertebral disc;

Retrograde degeneration

椎间盘退变是随着人年龄增长而出现的一种生理性退变过

程，随着年龄增长椎间盘在体积、形态、结构、组成及生物力学等方

面不断发生变化[1]。椎间盘退变是引发颈肩痛、腰背痛等症状的一个

重要因素。而椎间盘退变又可以继发脊柱节段性不稳、滑脱、椎管狭

窄、椎间盘突出、椎间盘源性腰背痛等一系列脊柱疾患[2]。目前治疗

方法主要是保守治疗和手术治疗，但没有一种可以从根本上逆转或延

缓椎间盘退变的方法。骨髓间充质干细胞(MSCs)在不同诱导条件下具

有向中胚层组织细胞分化的能力[3]， 在体外经合适条件诱导可以转化

为成软骨细胞[4]，参与软骨修复与再生。椎间盘内的髓核细胞与关节

软骨细胞有很多相似的性质，那么，将 MSCs 置于活体椎间盘内环境之

中，MSCs 是否可以存活?本实验旨在观察 MSCs 在活体兔椎间盘内的生

存状态，为进一步探讨 MSCs 向髓核样细胞分化的趋向性奠定实验基

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础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

3 月龄新西兰大白兔 24 只，雌雄不限，购自山东省农业科学

院畜牧兽医研究所。经基因转染红色荧光蛋白标记的兔 MSCs，购自广

州 Cyagen Biosciences 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MSCs 的准备 体外培养兔 MSCs，至第三或四代细胞状

态、活力最好时进行消化。在细胞培养瓶内加入由体积分数为 0.002 5

的 trypsin EDTA0.3 mL+体积分数为 0.003 的 PBS 混合液消化 5 min，

待细胞全部变为圆形漂浮，加入 3 mL 培养液终止消化， 1 000 r/min

离心 4 min，弃上清，加入 9 g/L 的 NaCl 溶液混成细胞悬浮液后计数，

调整细胞密度至 1×109/L，待用。

1.2.2 手术注射 MSCs 常规术前准备，将新西兰大白兔称质

量、麻醉(氯胺酮 80 mg/kg+地西泮 5 mg/kg)后左侧卧位置于手术操作

台上，取腰椎后外侧入路，于右侧髂后上棘上方逐层切开，显露椎旁

肌， 沿其腹侧钝性分离， 显露椎体及椎间盘(L2 3,L3 4,L4 5,L5

6),应用 29 G 微量注射器吸取兔 MSCs 悬液(1×109/L)25 mL 注射

入椎间盘髓核内(L3 4,L4 5,L5 6);取同体积 9 g/L 的 NaCl 溶

液注入 L2 3 椎间盘髓核内作为对照。注射针刺入深度为 0.3 mm,穿

破纤维环到达髓核后能够感觉明显落空感。常规关闭切口。术后给予

青霉素 100 万单位肌注。

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