类缺血皮质神经元对小鼠外源性神经干细胞增殖作用的影响.doc

类缺血皮质神经元对小鼠外源性神经干细胞
增殖作用的影响

作者：李力，万琪，刘勇红，张瑞国

【关键词】 ,神经干细胞

【Abstract】 AIM: To investigate the effects of cortical

neurons pretreated in ischemiclike condition on extrinsic

neural stem cells'proliferation. METHODS: The cortical neurons

pretreated under ischemiclike condition were cocultured with

neural stem cells and the number of survived neural stem cells

was detected by MTT assay. RESULTS: Compared with the two control

groups, the neural stem cells cocultured with

ischemicconditiontreated neurons had an accelerated

proliferative speed and a higher vitality in 23 weeks.

CONCLUSION: Cortical neuronal cells injured in ischemiclike

conditions can significantly promote the cocultured neural stem

cells proliferation.

【 Keywords 】 neural stem cells; ischemia;

transplantation

【摘要】 目的： 研究类缺血损伤的皮质神经元对外源性神

经干细胞增殖的影响作用. 方法：类缺血处理后的小鼠皮质神经细胞

与同种异体神经干细胞共培养，通过 MTT 法观察干细胞增殖情况. 结

1

果： 经与类缺血处理的神经细胞共培养的神经干细胞在 2~3 wk 内的

增殖速度明显高于各对照组. 结论：类缺血处理后的皮质神经元对外

源性神经干细胞的增殖有显著促进作用.

【关键词】 神经干细胞；缺血；移植

0 引言

神经干细胞（neural stem cells, NSCs）的发现对神经科学

研究具有划时代的意义. 能自我增殖和进行多方向分化，是神经干细

胞的两大特性. 对于中枢神经系统损伤， 一种具有前景的治疗策略是：

通过移植神经干细胞，诱导其增殖和定向分化来替换受损细胞以期恢

复功能. 这在帕金森(Parkinson)病动物模型实验及临床试验上已经

取得长足进展. 但是，对于缺血性脑血管病导致的皮质损伤而言，移

植神经干细胞是否有助于恢复还不完全清楚. 我们试图通过缺血损伤

的皮质细胞与神经干细胞体外共培养的方法对此作一个初步探讨.

1 材料和方法

1.1 材料① 动物：孕 13 d 昆明种二级孕鼠由第四军医大学

实验动物中心提供（陕动字 003 号）.② 主要试剂：rhbFGF, rhEGF

（Sigma)；N2 添加剂，胰酶阻断剂（Soybean Trypsine Inhibitor，

DF12（Gibco)；BrdU（Sigma）,胎牛血清（fetus bovine serum, FBS.

杭州四季青）. ③ 主要抗体：抗 nestin（BD） 抗 BrdU（Sigma） 抗
； ；

btubulin， （Zymed）抗 GalC Chemicon） ④ 部分用品：
GFAP ； （ . Culture

Plate Inserts （Millipore，商品名 Millicell, 孔径 0.22 mm, f

2

12 mm）.

1.2 方法

1.2.1 神经干细胞的培养参考 Reynolds 等［1］的方法：取

孕 13 d 昆明种二级孕鼠，处死后于无菌条件下取出胎鼠,体视显微镜

下分离出胎鼠纹状体,剪碎,经含 250 mg・L-1 的胰酶消化(37℃,

15 min), 离 心 800 r・min-1, 5 min, 弃 上 清 , STI 250

mL・L-1 终止消化(37℃, 8 min),以完全 DF12 培养基(bFGF 20

mg・L-1, EGF 20 mg・L-1, N2 添加剂,青、链霉素 1

×105 U・L-1)稀释至 7×108・L-1，接种于 75 mL 培养

瓶内, 置入 50 mL・L-1 CO2 的培养箱, 37℃培养. ( N2 添加

剂的组成：胰岛素 25 mg・L-1，转铁蛋白 100 mg・L-1，

孕酮 20 nmol・L-1，肉毒碱 60 mmol・L-1 ，亚硒酸钠

30 nmol・L-1).

1.2.2 神 经 干 细 胞 的 鉴 定 用 毛 细 管 选 出 单 一 神 经 球

（neurosphere） ，消化（胰酶 125 mg・L-1 5 min） 、吹打为单

细胞悬液,通过有限稀释法观察再培养 5~6 d 后是否有新神经球生成.

将新生成的神经球转移至经过多聚赖氨酸包被的 24 孔板内， 培养 继续

18 h，进行神经球的 nestin 染色. 部分新生神经球于传代时更换培养

基为含有 5 mmol・L-1 BrdU 的完全培养基. 继续培养 24 h

后， 进行 BrdU 染色. 部分新生成的神经球转移至经过多聚赖氨酸包被

的 4 孔板内，更换培养基为含有 100 mL・L-1 FBS 的 DMEM，4 d

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