人外周血单核细胞B7.2基因的克隆及其可溶剪接体的发现.doc

人外周血单核细胞 B7.2 基因的克隆及其可
溶剪接体的发现

作者：蔡荣钦，沈娟，林克波，邵红伟，黄树林

【摘要】 目的 研究 B7.2 基因在肿瘤免疫方面作用，从人外周血

单核细胞中克隆人 B7.2 基因的全长基因，并构建含此基因的重组质

粒。方法 根据人 B7.2 基因序列设计特异引物，用 RT-PCR、巢式 PCR

方法扩增 B7.2 基因的全长基因，并构建至 PGEM-T 载体中，测序鉴定

后进行序列分析。结果 成功构建 B7.2/PGEM-T 重组载体，并发现一种

新的 B7.2 异常的剪接体，保留第 1，2，3，5 外显子，第四外显子全

部缺失，共 144 bp，其编码蛋白质由此缺少一段跨膜结构。结论 新

剪接体在灵长类动物中的存在可能是个普遍现象，其对细胞功能有待

进一步的研究，为研究 B7. 2 编码蛋白质的结构和生物学功能及其在

肿瘤中的作用奠定基础。

【关键词】 B7.2；巢式 PCR；基因克隆；剪接体

Abstract:Objective B7 family members include B7.1 and

B7.2,which are important costimulatory molecules in immune

system. So we clone the full-length CDS of human B7.2 gene from

PBMC (peripheral blood mononuclear cell). Methods lt was

designed that specific primers of human B7.2 gene and gained its

full-length CDS by RT-PCR and nested PCR,then ligated the

objective fragment into pGEM-T vector and transformed into E.

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coli for screening. The positive clones which were identified

by Colony PCR were taken for sequence analysis. Results lt was

constructed that the B7.2/ pGEM-T recombinant plasmid

successfully and discovered a new B7.2 splice variant. This

variant keeps its exon 1,2,3,5,but its exon 4 is absent. This

lost exon takes 144 bp,which leads to an absence of a

trans-membrane region in the integrated B7.2 protein.Conclusion

The clone of human B7.2 gene lays solid base for the

investigation of the structure and function of B7.2 protein and

its biological effect in tumor immunology. However,the

potential impact of this new splice variant sill needs further

investigation.

Key words:B7.2; nested PCR; gene cloning; splice

variant

激活 T 淋巴细胞、T 细胞的完成活化有赖于双信号和细胞因

子的作用［1］ 首先 APC 将肽－MHC 复合物提呈给 T 细胞，TCR 特异性 ，

识别结合在 MHC 分子槽中的抗原肽， 启动抗原识别信号 （即第一信号） ；

同时还需要 APC 提呈第二信号，即 APC 上的协同刺激分子与 T 细胞表

面的相应受体相互作用——B7：CD28／CTLA4 共刺激信号［2］ T 细胞 。

在缺乏共刺激信号的情况下，抗原识别介导的第一信号非但不能有效

激活特异性 T 细胞，反而会导致 T 细胞无能。

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B7 家族分子主要包括 B7.1 和 B7.2，表达于单核细胞、树突

状细胞及巨噬细胞等，是 2 个提供协同刺激信号的重要分子［1］ 。

Martin-Fontech 等［3］报道，B7.2 在诱导排斥非免疫系肿瘤方面优

于 B7.1，并且在排斥免疫性肿瘤方面同样有效。由此可见，B7.2 分子

在协同刺激 T 淋巴细胞增殖、协同细胞介导的细胞毒作用等一系列生

物学效应中发挥了重要的作用［3］ 人 B7.2 基因定位于第 3 号染色体 。

(3q21) 4］其蛋白产物氨基端有一段 23 个氨基酸残基构成的信号肽， ［，

蛋白酶在 23～24 位丙氨酸之间切断信号肽， 产生由 306 个氨基酸残基

组成的分子量为 34 kD 的Ⅰ型跨膜蛋白，其中 220 个氨基酸残基构成

具有免疫球蛋白超家族( superfami1y) V 和 C 结构域的胞外区，含有

8 个潜在的 N-糖基化位点，23 个氨基酸残基构成疏水性跨膜区和 60

个氨基酸构成胞浆内区［5］ 。

本研究通过从人外周血单核细胞中克隆人 B7.2 编码区全长

基因，得到一个新的差异剪接体，为进一步研究 B7.2 所编码的蛋白质

结构和生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人新鲜血液由广州市血液中心提供，大肠杆菌 DH5a均由本

实验室保存，M-MLV 反转录试剂盒，pGEM-T 试剂盒购自 Promega 公司，

Taq plus 酶、 Trizol 购自 Fermentas 公司，人淋巴细胞分离液为 TD

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